survivin在微囊化肝細胞移植治療暴發(fā)性肝衰竭大鼠肝組織中的動態(tài)變化.pdf

1、暴發(fā)性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)是嚴重危害著人體健康的肝臟疾病,雖然肝移植術(shù)己明顯改善了FHF的預(yù)后,但是由于健康供肝短缺及昂貴的價格,難以滿足臨床需要.生物型人工肝與肝細胞移植是近年肝衰竭治療的研究熱點,但免疫排斥是其發(fā)展瓶頸,近幾年發(fā)展起來的微囊化肝細胞具有有效的免疫隔離屏障,在細胞移植中的研究正受到越來越多的關(guān)注.另外,殘存肝細胞能否及時有效再生并完全或部分發(fā)揮其功能也是FHF患者能否存活

2、的關(guān)鍵,是多因素、多環(huán)節(jié)的病理生理過程.近期survin在細胞凋亡和再生調(diào)控的分子機制中的一些重要發(fā)現(xiàn)使其成為研究熱點,有可能成為藥物及基因治療的可能靶點之一.本實驗將分離的正常大鼠肝細胞微囊化,移植到暴發(fā)性肝衰竭大鼠腹腔內(nèi),通過觀察大鼠肝功能和肝組織中survivin的變化等,探討微囊化肝細胞腹腔移植對FHF大鼠肝再生方面的影響. 方法：1.微囊化大鼠肝細胞的制備用Seglen改良二步胰酶灌注法對健康大鼠肝臟進行肝細胞分離及純

3、化,所得肝細胞懸液在血細胞計數(shù)板上作細胞計數(shù),用0.4﹪臺盼藍染色判斷細胞產(chǎn)量及活率.獲取的肝細胞在含有多種輔助因子的RP1640混合培養(yǎng)基中與2.0﹪海藻酸鈉等材料混勻,在自制裝置下制備微囊化肝細胞并觀察形態(tài)學(xué)特征. 2.將雄性成年SD大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖(D-GalN)制備.FHF模型,對照組注射同等體積的生理鹽水.將FHF模型大鼠在造模后18h隨機分成3組:Ⅰ組為培養(yǎng)液組;Ⅱ組為裸肝細胞移植組,腹腔內(nèi)植入游離同種異體

4、肝細胞:Ⅲ組為微囊化肝細胞移植組,大鼠腹腔內(nèi)植入微囊化同種異體肝細胞. 3.分別在造模后的24h、36h、48h、72h、120h、148h、240h動態(tài)觀察血清肝功能生化指標丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBil)的變化,留取肝組織用免疫組織化學(xué)方法(SABC法)檢測survivm蛋白的表達,每次以已知survivin陽性肝細胞癌切片作為陽性對照,PBS代替第一抗體作為陰性對照,每張切片

5、隨機選取5-10個高倍鏡視野(×400),計算每1000個肝細胞中survivin陽性細胞數(shù),為survivin標記指數(shù)(survivin labelmg index,survivn-LI),即survivin-LI=survivm陽性細胞數(shù)/1000x 100﹪.另每組隨機留取15只用來觀察存活率. 4. 用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測survivin mRNA的表達.三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為

6、內(nèi)參對照,100bp、250bp標準堿基確定PCR產(chǎn)物大小,1.5﹪瓊脂糖凝膠電泳后拍照,置凝膠電泳處理系統(tǒng)成像,TolallabV101軟件半定量分析survivin/GAPDH灰度比值. 5.取6只正常大鼠的血清及肝組織檢測以上指標作為正常對照. 結(jié)果：1. 每只大鼠分離純化后所得肝細胞經(jīng)0.4﹪臺盼藍染色判斷細胞產(chǎn)量為(8.4±0.97)×10<'7>,活率為91.83±2.48﹪. 2.獲取的肝細胞在含有

7、多種輔助因子的RPl640培養(yǎng)基中與2.0﹪海藻酸鈉等材料混勻,在自制裝置下制備微囊化肝細胞,經(jīng)0.4﹪臺盼藍染色后85﹪以上肝細胞成活,微囊大小在400μm-800μm之間. 3. 模型建立后24h,大鼠表現(xiàn)極度虛弱、活動明顯減少、食欲明顯減退、口腔有出血、精神萎靡、嗜睡、抽搐、昏迷等;血ALT、AST和TBil明顯升高:肝病理學(xué)表現(xiàn)為肝細胞壞死廣泛而嚴重,出現(xiàn)彌漫性的大片壞死,細胞溶解,肝索解離,小葉結(jié)構(gòu)模糊不清,失去正常的

8、肝組織結(jié)構(gòu),肝竇明顯擴張并出血,小葉內(nèi)及匯管區(qū)有淋巴細胞和巨噬細胞為主的炎癥細胞浸潤,殘存肝細胞水腫變性,這表明FHF動物模型成功建立. 4.肝功能衰竭模型建立后ALT、AST、TBil迅速升高(P<0.01),并于48h達高峰.同一時間點兩兩比較發(fā)現(xiàn),Ⅱ、Ⅲ組在48h、72h、120h、168h均明顯低于Ⅰ組(P<0.05,P<0.01),Ⅲ組在36h、48h、72h均低于Ⅱ組(P<0.01).Ⅱ、Ⅲ組峰值較Ⅰ組前移.三組存活

9、率比較有統(tǒng)計學(xué)差異: Ⅱ、Ⅲ組均高于Ⅰ組(P<0.05),Ⅲ組略高于Ⅱ組(P=0.05). 5. 各組肝組織survwin免疫組化情況:正常大鼠肝組織無或極微量survivin陽性表達(survivin-LI與其它組比較P<0.01);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均有明顯survivin陽性表達,survivin陽性細胞主要是肝細胞,以中央靜脈周圍和匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達最為明顯,在壞死區(qū)中心表達明顯少于周圍區(qū),各組組內(nèi)survivin-LI呈

10、一定規(guī)律性變化,均在第48h.72h達高峰,以后逐漸下降,至第7天時仍有少量陽性細胞,各組間同一時間點的survivin-LI有差異,Ⅱ、Ⅲ組在36h、48h、72h較Ⅰ組高(p<0.05),Ⅲ組24h、36h的survivin-LI較Ⅱ組略高(P<0.05),峰值略前移. 6. FHF大鼠肝組織中survivin mRNA的表達較正常組明顯增加(P<0.01),各組survivin mRNA表達在造模后的第72h-120h最高

11、,Ⅲ組的峰值較Ⅰ、Ⅱ組略前移,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組間同一時間點比較無顯著差異(P>0.05). 結(jié)論： 1. 腹腔注射D-GalN1.4/kg一次性造模成功,大鼠狀態(tài)、死亡率、肝臟組織學(xué)及生化學(xué)改變符合FHF. 2. Seglen改良二步胰酶灌注法對健康大鼠肝臟進行肝細胞分離及純化,所得肝細胞產(chǎn)量及活率符合HCT的要求,且價格低廉. 3.HCT'能降低FHF大鼠ALT、AST和TBil水平,減輕肝損傷程度,可能改

12、善FHF預(yù)后.微囊化同種異體肝細胞移植對FHF大鼠的干預(yù)優(yōu)于裸肝細胞. 4.FHF大鼠肝組織中有survivin表達,免疫組化顯示主要為肝細胞,以中央靜脈周圍和匯管區(qū)及壞死區(qū)周圍表達最為明顯,在壞死區(qū)中心表達明顯少于周圍區(qū),survivin表達的部位和量的變化規(guī)律提示其與肝細胞再生有關(guān).微囊化同種異體肝細胞移植可提高survivin mRNA和蛋白的表達,可能是通過參與抑制肝細胞凋亡和促進殘存肝細胞的再生發(fā)揮治療作用.