人腫瘤抑素的克隆、表達(dá)及其生物活性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的生成，如果能抑制新生血管的形成，腫瘤細(xì)胞將發(fā)生凋亡或壞死。目前，已有多種抑制新生血管生成的藥物用于抗腫瘤的研究。近來(lái)發(fā)現(xiàn)了一些分離于組織或體液的血管生成抑制物，它們是大分子蛋白的生物活性片斷。腫瘤抑素(tumstatin)是繼血管生成抑素(angiostatin)和內(nèi)皮抑素(endostatin)之后，最新發(fā)現(xiàn)的源于人基膜ColⅣ的腫瘤新生血管生成的抑制因子，分子量為28kDa，由244個(gè)氨基酸組成，包

2、括Col Ⅳα 3的NC1活性區(qū)域的232個(gè)氨基酸和中間3股螺旋區(qū)C-端的12個(gè)氨基酸。近來(lái)研究表明，Tumstatin有兩個(gè)不同的活性區(qū)，一個(gè)是N端的54～132氨基酸組成的78肽(tum-5)，其中74～98位氨基酸組成的T7肽可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，使腫瘤新生血管合成受到抑制，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。另一個(gè)是靠近C端的185～203氨基酸組成的19肽，直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其生長(zhǎng)。這些作用主要是通過(guò)Tumstatin和腫瘤新生

3、血管上特異高表達(dá)的整合素α v β 3結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的。整合素α v β 3是近來(lái)研究較多的一個(gè)腫瘤新生血管上較理想的靶位點(diǎn)，由于Tumstatin具有與其特異的結(jié)合能力，通過(guò)用<'131>I、<'99>Tc<'m>等放射性同位素標(biāo)記Tumstatin，進(jìn)行腫瘤的放射受體顯像，具有重要和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 在本研究中，我們從HEK293細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出人Tumstatin基因，將該基因?qū)肟寺≥d體pMD1

4、9-T中，通過(guò)菌落PCR、質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶鑒定和DNA序列分析，獲得重組質(zhì)粒pMD19-Tumstatin，然后亞克隆至表達(dá)載體pET28a(+)中，通過(guò)菌落PCR、酶切鑒定和序列分析，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-Tumstatin，然后將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌E．coli BL21(DE3)。分別對(duì)IPTG濃度、表達(dá)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和表達(dá)部位等表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)SDS-PAGE和Western Blot來(lái)鑒定。對(duì)表達(dá)的包涵體，

5、通過(guò)Ni柱親和層析來(lái)進(jìn)行純化。對(duì)洗脫下的目的蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，BCA法測(cè)定重組人Tumstatin蛋白濃度。并通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其抑制腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取的RNA經(jīng)電泳，有明顯的28S和18S兩條帶，且兩者亮度約為2：1，表明RNA比較完整，通過(guò)紫外測(cè)其濃度，RNA的濃度為7.63μg/μl。PCR產(chǎn)物電泳顯示在750bp附近有目的條帶，表明目的基因得到了擴(kuò)增。菌落PCR、酶切鑒定和序列分析等結(jié)果表明，成功的構(gòu)建了

6、含有人Tumstatin基因的表達(dá)載體pET28a(+)-Tumstatin。SDS-PAGE和Western Blot顯示在IPTG誘導(dǎo)下，重組人Tumstatin得到了表達(dá)，表達(dá)量約占菌體總蛋白的30％，主要以包涵體的形式存在。優(yōu)化的最佳表達(dá)條件為： IPTG終濃度為1 mM，誘導(dǎo)溫度為37℃，時(shí)間為5 hr。SDS-PAGE顯示，Ni柱親和層析時(shí)，當(dāng)洗脫的咪唑濃度為300mM時(shí)，目的蛋白被洗脫下來(lái)，得到了較純的蛋白。通過(guò)尿素梯度透