核因子-κB對人眼小梁細胞生長及分泌功能影響的實驗研究.pdf

1、背景及目的： 小梁細胞位于前房角的小梁網(wǎng)組織中，含有多種細胞因子受體，能分泌基質金屬蛋白酶(MMP)及細胞外基質(ECM)等多種成分，是維持小梁網(wǎng)結構及功能，保持房水外引流通暢的重要因素。小梁細胞功能障礙可導致房水外流阻力增大，眼壓升高引發(fā)青光眼。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性開角型青光眼患者的小梁細胞數(shù)量明顯低于正常人，小梁網(wǎng)組織中ECM含量增加。因此，深入研究調節(jié)小梁細胞增殖、凋亡和分泌功能的分子機制，對明確青光眼的發(fā)病機制以及指導青光眼的

2、治療具有重要的意義。 NF-κB是一個廣泛存在于細胞中具有多向調節(jié)作用的核轉錄因子，在細胞生長分化、增殖、凋亡、免疫應答、炎癥反應等生理及病理過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。NF-κB的活化是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)，NF-κB的過度活化與許多急慢性炎性相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。在青光眼的發(fā)生、發(fā)展及臨床治療過程中，時常伴有炎癥的發(fā)生，尤其是在外傷、葡萄膜炎所致的繼發(fā)性青光眼的發(fā)病過程中，前房炎癥反應所產(chǎn)生的大量炎癥介質及細胞因子，必然會

3、刺激小梁細胞NF-κB的活化。壓力應激反應可導致細胞NF-κB的活化，研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性青光眼小梁網(wǎng)NF-κB的表達也明顯高于正常人，而NF-κB的活化對青光眼的進程將會產(chǎn)生何種影響，目前仍不清楚。 NF-κB的活化對細胞生存至關重要，NF-κB可通過直接調控與細胞增殖相關基因及抗凋亡基因的表達，參與細胞增殖與凋亡的調控。此外，NF-κB還可以調控多種基質金屬蛋白酶的表達。臨床上長期應用糖皮質激素可導致繼發(fā)性青光眼的發(fā)生，而糖皮質激

4、素是NF-κB的拮抗劑，長期應用激素使NF-κB活性被過度抑制，繼而引發(fā)小梁細胞的凋亡是否是激素性青光眼的發(fā)病機制，目前亦尚不清楚。 為此，本研究擬以NF-κB為切入點，通過培養(yǎng)人眼小梁細胞，將NF-κB的活性亞基P65/RelA基因轉染入小梁細胞，觀察NF-κB在小梁細胞中的過度表達對小梁細胞的增殖、凋亡，以及基質金屬蛋白酶和TIGR基因轉錄和表達的影響。另一方面，采用圈套策略，即應用與NF-κB順式作用元件序列同源的寡核苷酸

5、序列抑制小梁細胞NF-κB的活化，觀察其對小梁細胞增殖、凋亡，以及基質金屬蛋白酶和TIGR基因的表達變化的影響。本課題試圖闡述NF-κB在小梁細胞功能障礙中的作用，了解NF-κB在不同活性情況下對小梁細胞的影響，討論其與青光眼發(fā)生的可能性。 材料方法： 人眼小梁細胞原代培養(yǎng)及鑒定：利用角膜移植術的供體眼組織，應用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)小梁細胞，采用免疫組化SP法，進行纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、Ⅳ型膠原、TIGR

6、蛋白及Ⅷ因子相關抗原鑒定。 細胞分組：采用培養(yǎng)在三到五代的小梁細胞進行實驗，隨機分為5組，正常對照組(C)，空質粒對照組(P65-C)，P65質粒組(P65)，隨機圈套對照組(ODN-C)，NF-κB圈套核苷酸組(ODN)P65質粒及NF-κB圈套核苷酸細胞轉染：采用脂質體轉染方法，利用熒光顯微鏡及WesternBolt法檢測轉染效果。 P65質粒轉染后小梁細胞培養(yǎng)液TNF-α含量檢測：轉染后24小時用ELISA法檢測細

7、胞培養(yǎng)液中TNF-α的含量。 NF-κB對小梁細胞增殖及凋亡的影響：分別應用MTT及3H-TdR摻入實驗檢測小梁細胞的增殖情況，用Tunel法檢測小梁細胞的凋亡。 NF-κB對小梁細胞基質金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑(TIMlP)表達的影響：應用RT-PCR方法檢測小梁細胞MMP-1，MMP-2，MMP-3及TIMP-1，TIMP-2mRNA的表達情況。 NF-κB對小梁細胞TIGR基因表達調控的影響：應用RT

8、-PCR及WesternBlot法分別檢測TIGR基因mRNA及蛋白質表達。 結果： 人眼小梁細胞培養(yǎng)成功，免疫組化鑒定LN、FN、Ⅳ型膠原及TIGR基因表達為陽性，Ⅷ因子相關抗原為陰性。 P65質粒轉染后24小時，小梁細胞P65的表達明顯升高，細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α含量顯著升高。 P65高表達抑制小梁細胞的增殖及DNA合成，促進小梁細胞凋亡增加。NF-κB圈套核苷酸同樣抑制小梁細胞的增殖及DNA合成

9、，并且促進小梁細胞凋亡的增加。 P65高表達促進小梁細胞MMP-1及MMP-3mRNA的表達，對MMP-2及TIMP-1，TIMP-2的表達無影響。NF-κB圈套核苷酸抑制小梁細胞MMP-1及MMP-3mRNA的表達，對MMP-2及TIMP-1，TIMP-2的表達無影響。 P65高表達抑制小梁細胞TIGR基因mRNA及蛋白質的表達，NF-κB圈套核苷酸促進小梁細胞TIGR基因mRNA及蛋白質的表達。 結論：

10、 P65促進小梁細胞分泌炎癥介質TNF-α，提示NF-κB過度活化可引發(fā)小梁細胞出現(xiàn)過度炎癥反應。 P65在小梁細胞中的過度表達抑制小梁細胞的增殖及DNA合成，并且促進小梁細胞凋亡的發(fā)生。提示前房過度炎癥反應可能影響小梁細胞的存活，炎癥繼發(fā)性青光眼的發(fā)生可能與NF-κB過度活化密切相關。 NF-κB圈套核苷酸抑制小梁細胞的增殖及DNA合成，并且促進小梁細胞凋亡的發(fā)生，說明NF-κB在正常情況下具有維持小梁細胞數(shù)量及功能

11、平衡的作用。提示NF-κB活性過度受抑可能是糖皮質激素性青光眼的發(fā)生機制之一。 NF-κB活化可促進小梁細胞MMP-1及MMP-3的表達，抑制NF-κB的活化則會抑制小梁細胞MMP-1及MMP-3的表達，說明NF-κB在調控小粱網(wǎng)細胞外基質平衡機制中占有重要的地位。提示長期應用NF-κB抑制劑，可能會導致小梁細胞MMP-1及MMP-3的分泌下降，造成小梁網(wǎng)ECM的過度堆積。 NF-κB的活化和抑制可促使小梁細胞TIGR基