豬源致病性沙門(mén)氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、本研以30株豬源致病性沙門(mén)氏菌為檢測(cè)菌株，進(jìn)行了各菌株的血清型鑒定，測(cè)定了該30株細(xì)菌對(duì)四大類(lèi)抗生素的最低抑菌濃度，建立了其耐藥基因的PCR檢測(cè)技術(shù)，構(gòu)建了耐藥基因的基因檢測(cè)芯片，建立了基因芯片檢測(cè)技術(shù)，對(duì)30株沙門(mén)氏菌的耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，主要內(nèi)容包括以下4個(gè)方面： 1、以豬源致病性沙門(mén)氏菌為被檢菌株，采用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行了菌株的血清型鑒定，結(jié)果30株菌分屬豬傷寒沙門(mén)氏菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、腸炎沙門(mén)氏菌和德?tīng)栙律?/p>

2、門(mén)氏菌5個(gè)血清型。根據(jù)GenBank上注冊(cè)的耐藥基因序列，采用DNAStarPrimerselect軟件設(shè)計(jì)了24對(duì)引物，對(duì)沙門(mén)氏菌氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和氯霉素類(lèi)四大類(lèi)抗生素的24種耐藥基因進(jìn)行了擴(kuò)增，建立了耐藥基因的PCR檢測(cè)方法。對(duì)擴(kuò)增到的11種DNA產(chǎn)物進(jìn)行了序列測(cè)定，采用DNAStarMegAlign軟件，將擴(kuò)增到的DNA產(chǎn)物同GenBank上注冊(cè)的相應(yīng)耐藥基因進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)它們之間有很高的同源率(≥95.9％)。

3、 2、采用平板稀釋法，選用氨基糖苷類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和氯霉素類(lèi)四大類(lèi)抗革蘭氏陰性菌的11種抗生素，對(duì)30株豬源致病性沙門(mén)氏菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果有28株菌至少對(duì)一種藥物有耐藥性(93.3％，28/30)；對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、磺胺甲基異惡唑、復(fù)方新諾明、鏈霉素、卡那霉素和氯霉素有耐藥性的菌株較普遍，在所有菌株中占的比例分別為83.3％(25/30)、80％(24/30)、80％(24/30)、76.7％(23/30)、60％(1

4、8/30)、56.7％(17/30)和56.7％(17/30)。采用已經(jīng)建立的PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)30株豬源致病性沙門(mén)氏菌的11種耐藥基因進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果至少含有一種耐藥基因的有28株(93.3％，28/30)，sulⅠ、aph(3')-Ⅱa、tetC、Cat1、tetA和aadA1耐藥基因較為普遍，檢出率分別為76.7％(23/30)、60％(18/30)、60％(18/30)、43.3％(13/30)、40％(12/30)和36.7％

5、(11/30)。將藥敏試驗(yàn)結(jié)果與耐藥基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者之間有很高的一致性(≥88％)。其中6株耐氟甲砜霉素的菌株中都檢測(cè)到了floR基因，符合率達(dá)到了100％。 3、以11種耐藥基因作為靶基因、細(xì)菌保守的16srRNA為定位基因、青霉素抗性基因BlaTEM-1為陽(yáng)性?xún)?nèi)參，構(gòu)建了耐藥基因檢測(cè)芯片。確定芯片點(diǎn)樣環(huán)境溫度為25℃、濕度為65％，各樣點(diǎn)中心距離為1000μm，樣點(diǎn)直徑為220μm。 4、在構(gòu)

6、建的耐藥基因基因芯片的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)耐藥基因的基因芯片檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了研究。首先將11種耐藥基因引物組合成四組，即MP1(aph(3')-Ⅱa+aadA1+tetC)、MP2(aadB+tetA+floR)、MP3(aadA2+CmlA+Cat1)和MP4(sulⅠ+sulⅡ)，建立了耐藥基因的多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記方法。將各組合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交，在對(duì)應(yīng)基因點(diǎn)樣處均出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，表明耐藥基因多重PCR擴(kuò)增標(biāo)記和雜交獲得成功。。本