RgpA基因疫苗防治種植體周?chē)椎膶?shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 種植體周?chē)资强谇粌?nèi)應(yīng)用種植體修復(fù)的主要并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為軟組織炎癥、牙齦出血、化膿和骨組織喪失。研究證明種植體周?chē)椎陌l(fā)生與齦下菌斑的附著有重要關(guān)聯(lián)，菌斑中主要是革蘭氏陰性厭氧菌，如牙齦卟啉單胞菌、伴放線(xiàn)放線(xiàn)桿菌等[1]。在患有種植體周?chē)椎姆N植體周齦溝內(nèi)會(huì)有大量的炎癥細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞，組織學(xué)觀察在種植體頸部有彈坑樣的骨喪失[2]。臨床上已有多種方法用來(lái)治療種植體周?chē)?，包括手術(shù)方式、傳統(tǒng)抗菌

2、藥物應(yīng)用、超聲潔治和激光治療等[3-4]。這些治療各有自身的優(yōu)點(diǎn)，但這些方法的應(yīng)用因患者具體情況不同，效果也存在不確定性，不能成為徹底有效的方法[5-12]。
　　 Gonzalez等選用小鼠構(gòu)建牙周炎模型，驗(yàn)證用牙齦卟啉單胞菌免疫動(dòng)物能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)以應(yīng)對(duì)牙周炎的發(fā)生發(fā)展[13-14]。但也有研究驗(yàn)證用菌體免疫動(dòng)物不如用專(zhuān)門(mén)的抗原序列效果好，抗原編碼序列構(gòu)建的質(zhì)粒免疫能夠誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫來(lái)對(duì)抗病原體，包括病毒、細(xì)菌和腫瘤

3、細(xì)胞等[15-17]。因此如果能利用此類(lèi)方法對(duì)抗引起種植體周?chē)椎牟【?，將有助于防治由?xì)菌感染引起的種植體炎癥的發(fā)生發(fā)展。
　　 牙齦卟啉單胞菌是牙周炎及種植體周?chē)椎闹饕虏【?，包含有多種毒性因子，如牙齦素、牙齦素復(fù)合體（稱(chēng)RgpA-Kgp復(fù)合體）、菌毛、脂多糖(LPS)、外膜泡、血凝素等。其中牙齦素是主要毒性因子，它包含有精氨酸特異性牙齦素R(Rgp)和賴(lài)氨酸特異性牙齦素K(Kgp)[18]。Rgp包含RgpA和RgpB兩種

4、，編碼基因分別為rgpA、rgpB，Kgp編碼基因?yàn)閗gp。它們?cè)谘乐苎椎闹虏∵^(guò)程中被驗(yàn)證有重要的作用:侵襲宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)組織破壞和骨吸收[19-20]。其中RgpA不僅影響細(xì)菌的定植和生長(zhǎng)，而且侵襲和破壞宿主組織、影響免疫反應(yīng)和血管系統(tǒng)導(dǎo)致牙周炎具有臨床癥狀，同時(shí)它還具有很好的免疫原性，可誘導(dǎo)機(jī)體的保護(hù)性應(yīng)答，被認(rèn)為是很有潛力的疫苗抗原。應(yīng)用rgpA基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠能夠誘導(dǎo)大量的免疫性特異性抗體產(chǎn)生，這比用菌體免疫更加優(yōu)越

5、。但該類(lèi)實(shí)驗(yàn)在大型動(dòng)物體內(nèi)尤其是種植體周?chē)椎姆乐沃胁](méi)有相關(guān)研究。而本實(shí)驗(yàn)的目的便是將基因疫苗在犬身上應(yīng)用，檢驗(yàn)其在防治該類(lèi)動(dòng)物口腔內(nèi)種植體周?chē)装l(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 目的:
　　 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-rgpA，并用重組質(zhì)粒免疫動(dòng)物，驗(yàn)證其在防治實(shí)驗(yàn)性種植體周?chē)装l(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 以牙齦卟啉單胞菌ATCC33277基因組為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增rgp

6、A基因片段，并將其連接到pVAX1真核表達(dá)載體上。
　　 6只實(shí)驗(yàn)犬被隨機(jī)分成A、B、C三組，拔除下頜雙側(cè)第二、三前磨牙后隨機(jī)植入螺紋圓柱型種植體，每只動(dòng)物植入4枚。3個(gè)月后，骨結(jié)合良好，分組進(jìn)行免疫。A組動(dòng)物給予重組質(zhì)粒pVAX1-rgpA，B組給予熱失活的牙齦卟啉單胞菌菌體，C組給予生理鹽水作為空白對(duì)照，每?jī)芍苤貜?fù)免疫一次，共計(jì)3次。
　　 最后一次免疫后2周（此時(shí)記為基線(xiàn)期），將浸泡有牙齦卟啉單胞菌菌液的絲線(xiàn)結(jié)扎在

7、一側(cè)種植體頸部，每2周更換一次，共3次，綁線(xiàn)后0、2、4、6周時(shí)進(jìn)行種植體周探診深度(PPD)檢測(cè)，探診出血指數(shù)檢測(cè)(BOP)，X線(xiàn)觀察。
　　 免疫開(kāi)始前、免疫結(jié)束后2周收集血液和唾液樣本，檢測(cè)血清IgG和唾液分泌型IgA抗體。
　　 最后將動(dòng)物給予過(guò)量麻藥處死，將種植體及其周?chē)浻步M織制作厚約50um的硬組織切片，亞甲基蘭染色，鏡下觀察并測(cè)量垂直性和水平性骨喪失程度。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建

8、pVAX1-rgpA質(zhì)粒。
　　 2、動(dòng)物免疫結(jié)束后結(jié)果顯示，A、B組動(dòng)物IgG、IgA抗體較未免疫前明顯增高（P＜0.05），且較C組顯示出更高的抗體水平(P＜0.05)。A組較B組抗體反應(yīng)更明顯，但兩組之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3、三組動(dòng)物探診深度在基線(xiàn)后4周開(kāi)始出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別，A、B組較C組PPD值小(P＜0.05)。但在6周時(shí)檢查，差別并不顯著。探診出血指數(shù)(BOP)在各組間并沒(méi)有明

9、顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別(P＞0.05)。
　　 4、組織切片觀察在種植體周骨喪失區(qū)有大量的炎癥細(xì)胞和細(xì)菌存在，尤其在螺紋結(jié)構(gòu)區(qū)域。A組綁線(xiàn)側(cè)種植體骨喪失不明顯，B、C組骨喪失比較嚴(yán)重。
　　 結(jié)論:
　　 1、rgpA基因構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒能有效誘導(dǎo)機(jī)體增強(qiáng)免疫反應(yīng)，減弱種植體周軟組織炎癥，降低種植體周?chē)椎墓菃适А?br>　　 2、用細(xì)菌菌體免疫雖然也有助于提高免疫抗體的分泌，卻不能有效阻止骨喪失的進(jìn)展，可以認(rèn)為