鋅脂蛋白A20抑制TLR4介導(dǎo)的人單細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 應(yīng)用TLR4特異性激動(dòng)劑脂多糖(LPS)刺激體外培養(yǎng)的人單核細(xì)胞，激活TLR4/NF-κB信號(hào)途徑，將含有A20基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入單核細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀(guān)察A20過(guò)表達(dá)后單核細(xì)胞膜受體TLR4表達(dá)的變化，以及對(duì)下游促炎因子TNF-α、IL-12及抗炎因子IL-10表達(dá)的調(diào)節(jié)，并進(jìn)一步研究A20過(guò)表達(dá)對(duì)促炎因子/抗炎因子即TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10比率的影響，以探討鋅脂蛋白A20對(duì)單核細(xì)胞炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用及

2、可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。 方法： 外周血經(jīng)EDTA抗凝，F(xiàn)icoll細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將單核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)整單核細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，實(shí)驗(yàn)設(shè)A組(為空白對(duì)照組，培養(yǎng)液中不加任何干預(yù)因素)；B組(為L(zhǎng)PS組，無(wú)血清培養(yǎng)48小時(shí)，在培養(yǎng)基中加入1mg/L的LPS作用24小時(shí))；C組(為A20轉(zhuǎn)染組，無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)染pCAGGS-GFP/A20質(zhì)粒陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物

3、培養(yǎng)48小時(shí))；D組(為L(zhǎng)PS+A20轉(zhuǎn)染組，無(wú)血清培養(yǎng)24小時(shí)，轉(zhuǎn)染pCAGGS-GFP/A20質(zhì)粒陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物培養(yǎng)48小時(shí)，于轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入1mg/L的LPS作用24小時(shí))。胰酶消化法收集以上各組單核細(xì)胞；采用免疫熒光方法檢測(cè)GFP報(bào)告基因，免疫組化檢測(cè)A20蛋白的表達(dá)；提取總mRNA用RT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性A20、外源性A20及TLR4的mRNA表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)TLR4的表達(dá)，以CD14+為單核細(xì)胞標(biāo)記，采用未