從“絡”論治缺血性腦損傷的微血管內(nèi)皮細胞調(diào)控機制研究.pdf

1、中風病因其高發(fā)病率，高死亡率，高致殘率，而成為醫(yī)藥界的重點攻克項目。中醫(yī)在中風病認識及治療上有幾千年歷史，近年來，在臨床及實驗研究方面已取得了可喜成就，但仍有許多問題亟待進一步解決。 王永炎院士認為，以毒邪和病絡作為深入研究的切入點，是進一步提高腦血管疾病療效的突破口所在?，F(xiàn)代研究已認識到血管內(nèi)皮不僅僅是血液與組織間物質(zhì)交換的屏障，而且是一個重要的內(nèi)分泌、旁分泌器官，具有強大的分泌、代謝功能。與既往的腦缺血離體實驗中多以神經(jīng)細胞

2、為研究目標不同，我們以腦微血管內(nèi)皮細胞(CMEC)做為研究的切入點，從一個全新的角度研究藥物防治缺血性腦損傷進行了有意義的探索，對于指導腦系疾病的中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究具有重要啟示。 本課題研究用藥為通絡救腦(TLJN)注射液，是治療缺血性腦病的中藥新藥。已完成驗收的“十五”國家攻關課題“通絡救腦注射液臨床前研究”在保護大鼠腦缺血組織損傷中獲得了優(yōu)良效果，并在“863”項目支持下的臨床試驗進一步肯定了其抗缺血損傷的效應。我們從“絡脈”

3、功能調(diào)控入手，以神經(jīng)血管單元(NVU)做為一研究體系，從細胞、分子及基因水平進一步研究TLJN注射液“解毒通絡”的藥效機制。以腦微血管內(nèi)皮細胞做為研究的切入點和樞紐，開展了腦微血管內(nèi)皮細胞調(diào)控機制的藥理學研究，旨在從理論與方法學兩方面對現(xiàn)有的腦系疾病防治研究進行有意義的補充和積極的探索。 實驗方案共分三個部分： 第一部分：系基礎研究，原代培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(rCMEC)，并做氧糖剝奪(OGD)缺血模型，觀察了TLJ

4、N注射液對其的保護效應及可能的黏附機制研究。 第二部分：收集正常、缺血及藥物干預的最佳時段腦微血管內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液，分別作用于正常、缺血及缺血再灌的大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞和皮層神經(jīng)元，研究生理及病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞分泌的活性物質(zhì)介導的神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞的生物學功能改變，探討腦微血管內(nèi)皮細胞與神經(jīng)血管單元(NVU)中另外兩種腦細胞的功能聯(lián)系。 第三部分：通過正常、缺血及TLJN干預的腦微血管內(nèi)皮細胞的基因芯片初探及部分差

5、異基因的進一步驗證，從整體基因表達水平來研究缺血對腦微血管內(nèi)皮細胞的影響及藥物對其的調(diào)控作用，進一步深化“毒損腦絡”病機理論的生物學內(nèi)涵，詮釋TLJN“解毒通絡”的微觀作用機制全貌。 研究結果： 1.成功地培養(yǎng)和鑒定了大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞，掃描電鏡觀察可見內(nèi)皮細胞有豐富的微絨毛，透射電鏡觀察可見典型的緊密連接結構，免疫組化對Ⅷ因子鑒定，其純度可達98％。 2.TLJN注射液對正常及缺血腦微血管內(nèi)皮細胞具有雙向調(diào)節(jié)

6、作用，藥物劑量與細胞增殖活性呈非線性關系。重復三次實驗，可以肯定TLJN小劑量范圍(0.5～8μL·ML-1)均促進了缺血腦微血管內(nèi)皮細胞活性，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05或P＜0.01)。 3.腦微血管內(nèi)皮細胞缺血6h時，E-選擇素和VCAM-1的表達均上調(diào)，提示CMEC缺血時啟動了黏附機制。TLJN注射液干預缺血CMEC，能夠下調(diào)E-選擇素(P＜0.01)，而對VCAM-1影響不大。E-選擇素黏附機制的始動因素之一，提示TLJ

7、N注射液可通過對E-選擇素這條通道的影響，抑制了黏附反應的啟動從而阻抑CMEC缺血損傷。 4.首次觀察分析了腦微血管內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液(CMECs-CM)中的活性物質(zhì)介導的神經(jīng)元的生物學功能改變。通過乳酸脫氫酶(LDH)釋放量的檢測結果表明：對于缺血及缺血再灌這種病理狀態(tài)下的神經(jīng)元，各類腦微血管內(nèi)皮條件培養(yǎng)液都起到了一定的抗損傷效應；而對正常神經(jīng)元卻表現(xiàn)為增加了LDH漏出率，即一定程度上增加了細胞膜損傷。再次通過細胞增殖活性的檢

8、測結果表明：N-CM、NT-CM及Rp-CM均抑制正常神經(jīng)元活性，而TLJN干預后的RT1-CM、RT2-CM無抑制效應，并且高濃度的RT1-CM還能促進正常神經(jīng)元的增殖活性，突顯出了TLJN通過CMEC介導的抗缺血性腦損傷效應；CMEC的Is-CM及IsT-CM均能提高缺血損傷神經(jīng)元的細胞活性；N-CM與NT-CM均能夠促進缺血再灌神經(jīng)元的活性，Rp-CM對缺血再灌神經(jīng)元的細胞活性效應無統(tǒng)計學意義，但TLJN干預后的RT1-CM、RT

9、2-CM卻均表現(xiàn)出提高缺血再灌神經(jīng)元的活性，體現(xiàn)了TLJN通過CMEC介導的保護缺血性腦細胞損傷的生物學效應。 5.以NVU為一研究體系，腦微血管內(nèi)皮細胞做為藥物靶細胞，同步培養(yǎng)和研究了NVU三種主要細胞即腦微血管內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞，在三種狀態(tài)即正常、缺血及缺血再灌時的功能聯(lián)系。結果表明，在同一生理或病理情況下，內(nèi)皮細胞確實表現(xiàn)了中心環(huán)節(jié)的關鍵調(diào)控作用，無論是正常、缺血或是缺血再灌三種狀態(tài)，同一種CMEC分泌的活性物

10、質(zhì)對神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞的調(diào)控效應卻表現(xiàn)出了高度的一致性；對比同一生理或病理的狀態(tài)下，無藥物干預與有TLJN干預的CMECs-CM對神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的生物學效應差別，亦發(fā)現(xiàn)了許多共性結果。如在正常生理情況下，未表現(xiàn)出TLJN注射液的藥物優(yōu)勢。但是在涉及病理情況時，其生物學效應均表現(xiàn)了有TLJN干預的內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液明顯比無藥物作用的條件培養(yǎng)液具有抗缺血性腦損傷或保護腦細胞的功能效應。從細胞生物學水平驗證了TLJN是通過“解毒通絡”

11、的作用機制發(fā)揮了糾正腦細胞病理狀態(tài)的藥物效應。 6.首例開展了正常、缺血及TLJN注射液干預的離體rCMEC的整體基因表達譜研究，獲得了大量的珍貴原始生物學信息。研究缺血與正常細胞的極顯著差異基因，從細胞功能構成部位及分子生物學功能兩方面進行了初步歸類。在已知的生物功能信息中，以參與酶活性、胞外分泌、轉(zhuǎn)運、受體活性、信號轉(zhuǎn)導、凋亡等生物學功能居于前位。 7.篩選出TLJN干預缺血腦微血管內(nèi)皮細胞后有興趣的3條差異基因，通