FGL2基因沉默對大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡的影響及相關分子機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　 特異性沉默心肌微血管內皮細胞FGL2基因的表達后，觀察細胞形態(tài)功能以及增殖、凋亡能力的變化；探討FGL2沉默在心肌微血管內皮細胞凋亡方面的作用機制。
　　 方法：
　　 (1)分離培養(yǎng)并鑒定MMVEC：取健康級新生雄性Wistar大鼠6～8 d8只，體重8～10 g，用組織貼塊法培養(yǎng)心肌微血管內皮細胞，至原代內皮細胞長成單層融合后，進行傳代。取第三代MMECs，免疫熒光檢測內皮細胞重要標志物FVⅢ及

2、CD31相關抗原。
　　 (2)從GeneBank中查找人纖維介素fg12(NM_006682)的堿基序列，按RNA干擾序列設計原則，設計4組針對FGL2基因cds區(qū)的靶序列，同時按公認標準設計合成無意義序列作陰性對照(PSCNC)。每組序列均按發(fā)卡結構模式設計合成，在其兩端設計酶切位點粘端，合成雙鏈DNA(引物)，與經(jīng)AgeI/EcoRI酶切的pGCSIL-GFP載體連接，產生pGCSIL-FGL2慢病毒載體，經(jīng)電泳篩選陽性克

3、隆，進行基因測序鑒定。再將慢病毒載體轉染293T細胞，包裝生產慢病毒，以系列稀釋法測定病毒滴度，Westernblot篩選出有效干擾靶點。DNA片段均由上海吉凱基因公司合成。
　　 (3)實驗分組：取培養(yǎng)的第三代MMVECs，共分三組：實驗A組：單純MMVECs(空白對照組)；實驗B組；空載質粒慢病毒轉染MMVECs組；實驗C組：FGL2RNAi慢病毒轉染MMVECs組。穩(wěn)定轉染4天后，熒光實時定量PCR(quantitativ

4、e real-time RT-PCR，qRT-PCR)檢測各組Bax、Bc1-2、Cox-2的mRNA表達。Westernblot檢測病毒轉染后MMVECs中FGL2蛋白的表達情況。病毒轉染后細胞的增殖能力用MTT法檢測。細胞的凋亡能力通過流式細胞儀檢測。
　　 結果：
　　 (1)原代心肌微血管內皮細胞培養(yǎng)成功，細胞呈典型的鋪路石樣結構，純度約95％左右。
　　 (2)免疫熒光法檢測，顯示90％以上的細胞CD3

5、1、FVⅢ陽性，CD31主要分布在細胞膜，呈紅色熒光，F(xiàn)VⅢ主要分布在細胞胞漿，呈綠色熒光。
　　 (3)通過基因測序，表明FGL2RNAi慢病毒載體構建成功。系列稀釋法測試包裝濃縮的慢病毒滴度為1×109TU/ml。轉染FGL2RNAi慢病毒96 h后，70-80％的MMVECs表達綠色熒光；MTT、流式細胞儀檢測結果顯示實驗C組與其它兩組細胞相比：細胞增殖能力明顯增強，凋亡明顯減少；qRT-PCR結果顯示，與實驗A組與B組比

6、較，實驗C組的FGL2、Bax、Cox-2表達明顯下調，Bc1-2的表達明顯上調，Westernblot檢測示：實驗C組FGL2蛋白表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而實驗A組與B組的差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 原代大鼠的心肌微血管內皮細胞培養(yǎng)成功，轉染FGL2RNAi慢病毒后的MMVECs中FGL2在RNA及蛋白水平表達明顯下調，在RNA水平Bc1-2表達明顯上調，Cox-2、Bax表達水平明