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文檔簡介
1、目的:
特異性沉默心肌微血管內皮細胞FGL2基因的表達后,觀察細胞形態(tài)功能以及增殖、凋亡能力的變化;探討FGL2沉默在心肌微血管內皮細胞凋亡方面的作用機制。
方法:
(1)分離培養(yǎng)并鑒定MMVEC:取健康級新生雄性Wistar大鼠6~8 d8只,體重8~10 g,用組織貼塊法培養(yǎng)心肌微血管內皮細胞,至原代內皮細胞長成單層融合后,進行傳代。取第三代MMECs,免疫熒光檢測內皮細胞重要標志物FVⅢ及
2、CD31相關抗原。
(2)從GeneBank中查找人纖維介素fg12(NM_006682)的堿基序列,按RNA干擾序列設計原則,設計4組針對FGL2基因cds區(qū)的靶序列,同時按公認標準設計合成無意義序列作陰性對照(PSCNC)。每組序列均按發(fā)卡結構模式設計合成,在其兩端設計酶切位點粘端,合成雙鏈DNA(引物),與經(jīng)AgeI/EcoRI酶切的pGCSIL-GFP載體連接,產生pGCSIL-FGL2慢病毒載體,經(jīng)電泳篩選陽性克
3、隆,進行基因測序鑒定。再將慢病毒載體轉染293T細胞,包裝生產慢病毒,以系列稀釋法測定病毒滴度,Westernblot篩選出有效干擾靶點。DNA片段均由上海吉凱基因公司合成。
(3)實驗分組:取培養(yǎng)的第三代MMVECs,共分三組:實驗A組:單純MMVECs(空白對照組);實驗B組;空載質粒慢病毒轉染MMVECs組;實驗C組:FGL2RNAi慢病毒轉染MMVECs組。穩(wěn)定轉染4天后,熒光實時定量PCR(quantitativ
4、e real-time RT-PCR,qRT-PCR)檢測各組Bax、Bc1-2、Cox-2的mRNA表達。Westernblot檢測病毒轉染后MMVECs中FGL2蛋白的表達情況。病毒轉染后細胞的增殖能力用MTT法檢測。細胞的凋亡能力通過流式細胞儀檢測。
結果:
(1)原代心肌微血管內皮細胞培養(yǎng)成功,細胞呈典型的鋪路石樣結構,純度約95%左右。
(2)免疫熒光法檢測,顯示90%以上的細胞CD3
5、1、FVⅢ陽性,CD31主要分布在細胞膜,呈紅色熒光,F(xiàn)VⅢ主要分布在細胞胞漿,呈綠色熒光。
(3)通過基因測序,表明FGL2RNAi慢病毒載體構建成功。系列稀釋法測試包裝濃縮的慢病毒滴度為1×109TU/ml。轉染FGL2RNAi慢病毒96 h后,70-80%的MMVECs表達綠色熒光;MTT、流式細胞儀檢測結果顯示實驗C組與其它兩組細胞相比:細胞增殖能力明顯增強,凋亡明顯減少;qRT-PCR結果顯示,與實驗A組與B組比
6、較,實驗C組的FGL2、Bax、Cox-2表達明顯下調,Bc1-2的表達明顯上調,Westernblot檢測示:實驗C組FGL2蛋白表達明顯下調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而實驗A組與B組的差異無統(tǒng)計學意義。
結論:
原代大鼠的心肌微血管內皮細胞培養(yǎng)成功,轉染FGL2RNAi慢病毒后的MMVECs中FGL2在RNA及蛋白水平表達明顯下調,在RNA水平Bc1-2表達明顯上調,Cox-2、Bax表達水平明
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