豬TRIM11基因克隆及其對豬偽狂犬病毒增殖影響的研究.pdf

1、TRIM蛋白是以三基序結構(也叫做RBCC結構域)為特點的蛋白家族，TRIM蛋白參與了各種細胞過程，包括細胞增殖，分化，癌癥發(fā)生以及凋亡等。許多TRIM蛋白可以作為固有免疫的組分或直接與病毒組分作用調(diào)控病毒的感染過程。TRIM11是TRIM蛋白家族的一員，對于人TRIM11的研究發(fā)現(xiàn)TRIM11可以抑制HIV-1的侵入，復制與釋放，發(fā)揮抗病毒作用，又可以負調(diào)控IRF3的激活促進HSV-1的感染，可見TRIM11在病毒感染過程中有著復雜的

2、調(diào)節(jié)作用。目前關于豬TRIM11基因的研究很少，本文構建了穩(wěn)定表達豬TRIM11的PK15細胞系，為進一步研究豬TRIM11的生物學活性奠定了基礎。
　　為了研究豬TRIM11對偽狂犬病毒感染的作用，本研究從豬頜下淋巴結cDNA中擴增出豬TRIM11編碼序列，對TRIM11基因進行分析，進行了組織表達譜分析和系統(tǒng)進化分析。利用PiggyBac轉座子系統(tǒng)構建真核表達載體PB-TRIM11并將重組載體轉染PK15細胞，通過嘌呤霉素篩選

3、及qRT-PCR鑒定獲得穩(wěn)定表達細胞系。用0.1MOI PRV感染過表達TRIM11PK15細胞和轉染PB空載體對照組細胞，分別于感染后0h，12h，24h，36h收獲細胞上清，檢測PRV的滴度(TCID50)。用0.1MOI PRV感染PK15細胞，于感染后0h，12h，24h，36h收獲細胞，提取細胞RNA反轉錄為cDNA檢測TRIM11轉錄水平的變化。用0.1MOI PRV感染過表達TRIM11PK15細胞和轉染PB空載體對照組細

4、胞，同時設不感染PRV對照，于感染后12h收獲細胞，提取細胞RNA反轉錄為cDNA檢測IFN-β轉錄水平的變化。用IFN-β-Luc轉染過表達TRIM11PK15細胞和轉染PB空載體對照組細胞，之后兩組細胞接種0.1MOI PRV，同時設不接種病毒對照組，于感染后12h收獲細胞，用雙熒光素酶報告基因檢測IFN-β啟動子活性的變化。
　　結果表明，豬TRIM11的ORF長度為1407bp，編碼468個氨基酸，蛋白分子量53kDa，等

5、電點為5.409，其蛋白有3個TRIM家族保守的結構域，這三個結構域從N端到C端的順序依次是RING結構、2個B-box結構域、一個卷曲結構域(Coiled-coil domain)。此外該蛋白C端結構域為最常見的PRY結構域和SPRY結構域。組織表達譜分析的結果顯示，豬TRIM11基因在脂肪組織、肺的表達量較高，而在心臟，回腸，十二指腸，直腸中的表達量較低。基因測序結果顯示克隆的豬TRIM11cDNA序列正確并成功構建了真核表達載體P

6、B-TRIM11，qRT-PCR檢測結果表明TRIM11在PK15細胞系中成功表達。檢測感染PRV后過表達TRIM11PK15細胞和對照組細胞上清液病毒的TCID50發(fā)現(xiàn)過表達TRIM11組的病毒滴度始終高于對照組，這種差異在12h時更明顯(P＜0.05)。提示，過表達TRIM11促進了PRV的增殖，這種作用在PRV感染早期更顯著。PRV感染可以抑制PK15細胞中TRIM11的轉錄水平。TRIM11過表達促進了PRV感染過程中PK15細