蛋白激酶C活性變化對(duì)adipophilin介導(dǎo)脂質(zhì)蓄積的影響.pdf

1、膽固醇等中性脂質(zhì)的蓄積是動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞形成和四期病變發(fā)生的核心環(huán)節(jié)。在真核細(xì)胞中,這些蓄積的脂質(zhì)主要以脂滴的形式貯存于胞漿中。Adipophilin就是脂滴外周40余種相關(guān)蛋白中含量最高的一種。其功能主要是促進(jìn)細(xì)胞中脂質(zhì)的蓄積,抑制膽固醇的外流。在adipophilin基因啟動(dòng)子區(qū)有過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體PPAR各亞型的反應(yīng)元件PPRE,能夠與PPARγ1、PPARγ2結(jié)合并調(diào)控人adipophilin基因的表達(dá)。而參與多種脂

2、質(zhì)代謝靶基因調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子PPARs可以和轉(zhuǎn)錄共激活物PBP作用,直接接受信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵酶PKC的磷酸化調(diào)控。研究adipophilin在脂質(zhì)蓄積中的調(diào)控因素尤其是具有良好藥物開(kāi)發(fā)價(jià)值的PKC信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,有可能為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的防治帶來(lái)新的契機(jī)。本研究首先在動(dòng)脈粥樣硬化新西蘭白兔模型上觀(guān)察Adipophilin和PKCα的表達(dá);然后在細(xì)胞水平上觀(guān)察oxLDL對(duì)A10大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、THP-1人巨噬細(xì)胞和ECV304人臍靜脈內(nèi)

3、皮細(xì)胞PKC活性和PPARγ與Adipophilin表達(dá)的影響;進(jìn)一步應(yīng)用PKC激動(dòng)劑PMA和抑制劑CalphostinC觀(guān)察PKC活性的改變對(duì)荷脂THP-1巨噬細(xì)胞中PKCα、PPARγ和Adipophilin表達(dá)的影響,并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的改變情況,以初步探討信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵酶PKC調(diào)控adipophilin及脂質(zhì)蓄積的可能機(jī)制。
　　第一部分動(dòng)脈粥樣硬化新西蘭白兔Adipophilin和PKCα表達(dá)的變化
　　目

4、的：在動(dòng)脈粥樣硬化新西蘭白兔動(dòng)物模型上,觀(guān)察Adipophilin和PKCα表達(dá)的變化。
　　方法：采用本課題組建立的新西蘭兔動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型。24只新西蘭白兔,隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。用高膽固醇飲食飼喂新西蘭白兔12w,動(dòng)脈切片HE染色;采用Westernblot蛋白印跡和免疫組化染色檢測(cè)Adipophilin和PKCα表達(dá)。
　　結(jié)果：喂養(yǎng)12周后頸總動(dòng)脈放血處死動(dòng)物,實(shí)驗(yàn)組新西蘭白兔病變主動(dòng)脈區(qū)可見(jiàn)內(nèi)膜增生、中膜增

5、厚,脂質(zhì)條紋突起,增生內(nèi)膜內(nèi)蓄積有大量的泡沫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組主動(dòng)脈病變區(qū)adipophilin和PKCα表達(dá)上調(diào),與adipophilin陽(yáng)性顆粒僅局限于增生內(nèi)膜不同,PKCα在內(nèi)膜、近內(nèi)膜的中膜區(qū)均呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。
　　結(jié)論：動(dòng)脈粥樣硬化新西蘭白兔主動(dòng)脈明顯增厚,病變區(qū) Adipophilin, PKCα表達(dá)上調(diào)。
　　第二部分 OxLDL對(duì)A10、THP-1及ECV304三種細(xì)胞PKC活性和巨噬細(xì)胞PPARγ與Adipophi

6、lin表達(dá)的影響
　　目的：以A10、THP-1及ECV304三種細(xì)胞為研究對(duì)象,觀(guān)察氧化型低密度脂蛋白對(duì)三種細(xì)胞PKC活性和PPARγ與Adipophilin表達(dá)的影響。
　　方法：用0,10,20,40,80μg/ml oxLDL共孵育24h,PepTag?非放射性蛋白激酶檢測(cè)法對(duì)荷脂細(xì)胞胞膜中 PKC活性進(jìn)行定性定量檢測(cè)---瓊脂糖凝膠電泳分離磷酸化條帶,觀(guān)察活性變化的趨勢(shì),紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)570nm吸光度,定

7、量酶的絕對(duì)活性;半定量RT-PCR和Westernblot檢測(cè)adipophilin、PPARγ和α亞型PKC表達(dá)的變化情況;油紅O染色觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。
　　結(jié)果：隨著 oxLDL濃度的增加,A10細(xì)胞膜 PKC活性從靜息狀態(tài)的0.2613±0.0521units/ml陡增至0.7685±0.0869units/ml;THP-1巨噬細(xì)胞由0.0670±0.0091units/ml增至0.1357±0.0235units/m

8、l;ECV304內(nèi)皮細(xì)胞由0.0550±0.0075units/ml增至0.1216±0.0187units/ml,其中平滑肌細(xì)胞膜活性增幅最大。RT-PCR和Westernblot檢測(cè)顯示平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)adipophilin;隨著氧化低密度脂蛋白濃度的增加,THP-1巨噬細(xì)胞adipophilin、PPARγ和α亞型PKC表達(dá)明顯增強(qiáng)。油紅O染色顯示細(xì)胞內(nèi)脂滴增加,部分融合成大脂滴。
　　結(jié)論：oxLDL濃度依賴(lài)性的

9、增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白激酶 PKC活性;adipophilin只表達(dá)于THP-1巨噬細(xì)胞;oxLDL明顯的上調(diào)PKCα、PPARγ和Adipophilin的表達(dá),其中,oxLDL對(duì)PKCα的作用最顯著;oxLDL可以促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞中脂滴的蓄積。
　　第三部分蛋白激酶C在adipophilin促THP-1巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用研究
　　目的：以THP-1巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,觀(guān)察PKC激動(dòng)劑PMA和抑

10、制劑Calphostin C對(duì)胞膜PKC活性、胞膜PKCα及胞漿內(nèi)PPARγ和adipophilin表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響,初步探討PKC調(diào)控adipophilin表達(dá)和脂質(zhì)蓄積的作用機(jī)制。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)部分:第一部分分組,10μl DMSO溶媒對(duì)照組;50μg/ml oxLDL+10μl DMSO組;50μg/ml oxLDL+100nmol/l PMA組;50μg/ml oxLDL+300nmol/lCalpho

11、stin C組,各組均在含2g/L BSA無(wú)血清培養(yǎng)基中與THP-1巨噬細(xì)胞共孵育16h;第二部分分組,50μg/ml oxLDL+10μl DMSO組;50μg/ml oxLDL+25nmol/lCalphostin C組;50μg/ml oxLDL+50nmol/lCalphostin C組;50μg/mloxLDL+100nmol/lCalphostinC組;50μg/ml oxLDL+200 nmol/l CalphostinC

12、組;50μg/ml oxLDL+400nmol/lCalphostin C組均在含2g/L BSA無(wú)血清培養(yǎng)基中與 THP-1巨噬細(xì)胞共孵育細(xì)胞16h。檢測(cè)方法及指標(biāo)同第二部分。
　　結(jié)果：100nmol/l PMA在激活胞膜 PKC(0.2514±0.0154units/ml)的同時(shí)可以與oxLDL協(xié)同增強(qiáng)PKCα、PPARγ和Adipophilin表達(dá)并使細(xì)胞內(nèi)脂滴的蓄積極大的增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯/總膽固醇比值增至69.8±9

13、.5％;300nmol/lCalphostin C對(duì)荷脂THP-1巨噬細(xì)胞的處理則抑制酶活性至0.0927±0.0056units/ml,細(xì)胞內(nèi)脂滴減少,膽固醇酯/總膽固醇比值降至40.1±9.1%;Calphostin C呈劑量依賴(lài)性的方式下調(diào)酶活性、PKCα、PPARγ和Adipophilin表達(dá),400nmol/lCalphostin C基本上可以逆轉(zhuǎn)50μg/ml oxLDL誘導(dǎo)的酶活化和PKCα、PPARγ和Adipophil

14、in表達(dá)的上調(diào)。
　　結(jié)論：佛波酯PMA增加荷脂THP-1巨噬細(xì)胞的蛋白激酶C活性,與oxLDL協(xié)同增強(qiáng)adipophilin、PPARγ和PKCα的表達(dá),并進(jìn)一步促進(jìn)脂滴的蓄積和提升膽固醇酯/總膽固醇比值;抑制劑Calphostin C降低荷脂巨噬細(xì)胞胞膜PKC活性,減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積,并呈劑量依賴(lài)性的下調(diào)Adipophilin、PPARγ和PKCα的表達(dá)。
　　總結(jié)：①動(dòng)脈粥樣硬化新西蘭白兔主動(dòng)脈病變區(qū)Adipophi

15、lin, PKCα表達(dá)上調(diào)。
　?、趏xLDL濃度依賴(lài)性的增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的蛋白激酶PKC活性;adipophilin只表達(dá)于THP-1巨噬細(xì)胞;oxLDL明顯的上調(diào)PKCα、PPARγ和Adipophilin的表達(dá),其中,oxLDL對(duì)PKCα的作用最顯著;oxLDL可以促進(jìn)THP-1巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)蓄積。
　　③佛波酯PMA增加荷脂THP-1巨噬細(xì)胞的蛋白激酶C活性,與oxLDL協(xié)同增強(qiáng)adipophili