SRBSDV12個(gè)基因植物表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因水稻表型初探.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV），是呼腸孤病毒科（Reoviradae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的一個(gè)暫定新種。該病毒侵染水稻后病株表現(xiàn)矮縮，葉色深綠，葉片基部產(chǎn)生皺褶，莖節(jié)部有倒生須根及莖表瘤突、高節(jié)位分蘗及根系褐化。前人研究發(fā)現(xiàn)SRBSDV全基因組由10條線性dsRNA組成，根據(jù)各片段從大到小分別命名為S1~S10，其中S5、S7和S9分別編碼兩個(gè)蛋白其余各片段均編碼一個(gè)蛋白。目前，SRBSDV部分基因功能及其致病機(jī)理尚

2、未清晰，尤其是病毒蛋白與寄主水稻之間的互作機(jī)制方面仍需要更深入的探索。為研究 SRBSDV各基因所編碼蛋白的功能和致病機(jī)理，本研究分別構(gòu)建了 SRBSDV12個(gè)基因的植物表達(dá)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，分別獲得由SRBSDV S1和S10編碼的RdRP和CP轉(zhuǎn)水稻植株，并重點(diǎn)對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因水稻的表型進(jìn)行觀察和利用 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè) CP的相對(duì)表達(dá)量。取得如下研究結(jié)果：
　　1.克隆了SRBSDV12個(gè)編碼基因，構(gòu)建了12個(gè)基因的

3、植物表達(dá)載體，并獲得了相應(yīng)的工程農(nóng)桿菌。通過RT-PCR，以SRBSDV感病水稻葉組織總RNA為模板，擴(kuò)增獲得了病毒 S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S6、S7-1、S7-2、S8、S9-1、S9-2和 S10編碼的共12個(gè)基因，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后連接到植物表達(dá)載體pCambia1302上，獲得各基因的植物表達(dá)重組質(zhì)粒，分別命名為 pC1302-P1、pC1302-P3、pC1302-P4、pC1302-P51、pC1302-P52、p

4、C1302-P6、pC1302-P71、pC1302-P72、pC1302-P8、pC1302-P91、pC1302-P92和pC1302-P10，利用電激法將上述重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105菌株中。
　　2.分別獲得了4株轉(zhuǎn)RdRP和6株轉(zhuǎn)CP的水稻植株。以水稻品種“日本晴”胚性愈傷組織為受體，用攜帶植物表達(dá)重組質(zhì)粒pC1302-P1和pC1302-P10的農(nóng)桿菌EHA105侵染愈傷組織，經(jīng)過潮霉素抗性篩選，預(yù)分化和分化

5、，生根煉苗等過程分別獲得4株P(guān)1陽性和6株P(guān)10陽性植株，Southern blot檢測(cè)外源基因S10均為單拷貝。
　　3.對(duì)T1代 P1轉(zhuǎn)基因水稻植株的表型進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，各株系 T1代群體幼苗期時(shí)與非轉(zhuǎn)基因水稻表型沒有明顯差異。分蘗期時(shí)，部分轉(zhuǎn)基因水稻植株表現(xiàn)出白化現(xiàn)象。白化植株的心葉表現(xiàn)正常，但其余葉片均有不同程度的白化，且長勢(shì)較弱。
　　4.獲得了T1代P10轉(zhuǎn)基因水稻植株，并對(duì)其進(jìn)行了分子檢測(cè)和表型觀察。對(duì)T1代P1

6、0轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，6個(gè)株系的外源基因基本均以3:1的比例進(jìn)行遺傳分離，符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律。T1代P10轉(zhuǎn)基因植株幼苗期時(shí)與非轉(zhuǎn)基因植株沒有明顯的表型差異。分蘗期時(shí)，部分轉(zhuǎn)基因植株長勢(shì)明顯減弱，表現(xiàn)出矮化，分蘗減少等表型。
　　5．建立了轉(zhuǎn)基因水稻病毒CP相對(duì)表達(dá)量RT-qPCR檢測(cè)技術(shù)。利用RT-qPCR技術(shù)，分別在幼苗期、分蘗期和抽穗期對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻植株的病毒CP的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，外源