染色體的易位、重排與B細胞淋巴瘤發(fā)病關系的初步研究.pdf

1、對淋巴瘤的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(IgVH)基因分析始于上世紀80年代，人們發(fā)現(xiàn)根據IgVH基因的體細胞突變(somaticmutation，SM)狀況有助于判斷B細胞腫瘤的細胞來源。1999年Hamblin等根據IgVH基因是否存在SM將慢性淋巴細胞白血病分為預后不同的兩類。該研究重新燃起了人們對IgVH基因研究的熱情，此后關于不同淋巴瘤IgVH基因突變狀況的大樣本研究陸續(xù)展開。IgVH基因作為一種獨特的免疫球蛋白受體表達于大多數的B細

2、胞淋巴瘤，檢測IgVH基因的突變狀況是追蹤腫瘤發(fā)展階段的一個有用方法。 以往對彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的研究表明這類腫瘤絕大多數含有突變的VH基因，說明該腫瘤曾經歷過體細胞突變。然而在腫瘤細胞中這種體細胞突變是否仍在持續(xù)進行(即克隆內超突變，intraclonalhypermutation)，以及如果存在克隆內超突變，該腫瘤細胞是來自于正常細胞的某一特定階段抑或是與細胞本研究獲浙江省自然科學研究基金(編碼Y205292

3、)和衛(wèi)生廳科學研究基金(編碼2006A084)資助來源無關的本身固有特性?為了回答這個問題，我們對34例DLBCL病例進行分類，并檢測IgVH基因，以期對DLBCL的分子特征有進一步的了解。 自從1972年在Burkitt淋巴瘤中首次發(fā)現(xiàn)染色體t(8；14)易位以來，越來越多的研究證據表明染色體易位在B細胞淋巴瘤的發(fā)病中發(fā)揮了重要作用。染色體易位與非霍奇金淋巴瘤(NHL)的組織學亞型、免疫表型和臨床表現(xiàn)密切相關。染色體易位導致融

4、合基因的形成，從而編碼具有特定生化性質的融合蛋白，改變了該基因的表達。 染色體t(14；18)(q32；q21)易位是NHL中最常見的染色體易位，見于85％-90％的濾泡性淋巴瘤(FL)，在FL的發(fā)病中起了重要作用。t(14；18)染色體易位的結果是產生一條衍生型的14號染色體，使BCL-2基因從正常的18q21位置上斷裂下來，與14號染色體免疫球蛋白重鏈基因(IgH)的增強子序列并置，從而導致BCL-2基因激活。有實驗表明轉染

5、了BCL-2/IgH的小鼠，在延長細胞存活時間的基礎上，更表現(xiàn)出發(fā)生淋巴瘤的傾向。 染色體t(14；18)(q32；q21)易位不僅見于85％-90％的FL，在約30％的DLBCL中也出現(xiàn)此易位，其中除由FL轉化而來的DLBCL在18％-20％的原發(fā)性DLBCL中可見到此易位。t(14；18)易位在原發(fā)性DLBCL中有何意義，它是否也像在FL中那樣代表了由發(fā)生中心細胞起源的腫瘤呢? 染色體t(14；18)易位作為FL的分

6、子遺傳學特征，近年來應用高度敏感的PCR在50％-70％的歐美正常人群外周血中亦檢出此易位。該發(fā)現(xiàn)提示歐美正常人群中的這一遺傳背景似乎與歐美人群中FL較亞洲人群高發(fā)有關。根據現(xiàn)代對腫瘤發(fā)生“多步打擊學說”理論的理解，歐美正常人群中的這一遺傳背景可能是FL發(fā)生多步環(huán)節(jié)中較早的一環(huán)。對于亞洲正常人群，包括我國在內，BCL-2/IgH易位頻率與相應地區(qū)FL低發(fā)生率相關性的研究較少。 在本實驗中我們對DLBCL中出現(xiàn)BCL-2/IgH易

7、位的意義作了初步的研究。另外我們也初步探討了浙江地區(qū)漢族人群中BCL-2/IgH易位現(xiàn)象，以期獲得中國浙江地區(qū)人群中BCL-2/IgH易位的遺傳特征。 一.實驗材料 (1)正常人血標本：收集浙江地區(qū)漢族196名健康體檢者(男性94名，女性102名)的外周血。 (2)淋巴瘤標本：收集1997-2004年我醫(yī)學院附屬醫(yī)院及省內其它醫(yī)院34例原發(fā)性DLBCL標本。全部標本經中性福爾馬林固定、石蠟包埋、HE染色。根據20

8、01年WHO關于淋巴及造血組織腫瘤分類對所有病例進行分類。 二.方法步驟 (1)DNA抽提：外周血標本應用鹽析法獲得單核細胞DNA；淋巴瘤石蠟標本應用經典蛋白酶K-酚氯仿法抽提腫瘤組織的DNA。 (2)應用抗體CD10，BCL6,MUM1在腫瘤組織中行免疫組化檢測，根據抗體的表達情況將DLBCL病例分為發(fā)生中心(GC)亞型與非發(fā)生中心(non-GC)亞型。用抗體BCL-2在腫瘤組織中行免疫細化檢測。 (3

9、)IgVH基因檢測：采用半巢式PCR，對所有DLBCL病例應用FR2A引物檢測IgVH基因重排，分析體細胞突變狀況。在5例發(fā)生中心亞型的病例及5例隨機抽取的非發(fā)生中心亞型病例中對IgVH基因進行TA克隆，分析克隆內超突變狀況。 (4)BCL-2/IgH易位基因檢測：對DLBCL病例應用單對引物PCR擴增易位片段。對外周血標本應用巢式PCR擴增易位片段，并將PCR產物直接測序。 (5)統(tǒng)計：采用SPSS11.5軟件，x2檢

10、驗，F(xiàn)isher's精確概率法以及Spearman's相關性分析方法。 三.結果 (1)本組34例DLBCL病例中8例屬于GC亞型，26例病例認為是非GC亞型的。 (2)本組34例DLBCL病例中應用FR2A引物檢測IgH重排，22例可見陽性條帶。其中8例GC亞型DLBCL病例中5例出現(xiàn)陽性條帶。 (3)本組22例DLBCL重排陽性病例中出現(xiàn)23個VH基因片段，分別來自7個人類VH基因家族中的4個，其中V

11、H3使用頻率最高。VH片段與相應胚系基因相比較突變頻率為0-18.60％，平均為7.72％。 (4)對全部5例重排陽性的GC亞型DLBCL病例和5例隨機選擇的非GC亞型DLBCL病例進行克隆內超突變分析顯示，在5例GC亞型病例中4例出現(xiàn)克隆內超突變，而在5例非GC亞型的DLBCL病例中均未出現(xiàn)克隆內超突變。兩組之間存在明顯差異。 (5)本組34例DLBCL病例中有4例存在BCL-2/IgH易位，陽性率為11.8％。其中3

12、例出現(xiàn)在GC亞型病例中，1例出現(xiàn)在非GC亞型病例中。在4例BCL-2/IgH易位病例中，2例存在BCL-2蛋白表達，2例無BCL-2蛋白表達。 (6)本樣本人群中BCL-2/IgH易位率為9.66％，低于歐美人群。 (7)正常人群中BCL-2/IgH易位在MBR區(qū)的斷裂位點主要集中于bp3055,3115,3165三個位點附近，6個JH片段使用率以JH6片段為最高。 (8)BCL-2/IgH易位可能存在雙克隆起源