CD248在人腦膠質(zhì)瘤微血管周細胞中的表達規(guī)律及其介導(dǎo)周細胞促血管生成作用的研究.pdf

1、腫瘤血管生成在腫瘤的生長、演進及轉(zhuǎn)移等方面有著重要的作用，因此，針對腫瘤的抗血管生成具有重要意義。惡性膠質(zhì)瘤由于生長部位的特殊性及生長的侵襲性，外科手術(shù)根治難度大，而放療和化療效果亦不理想。因此，針對膠質(zhì)瘤的抗血管生成治療則顯得尤為重要。腫瘤微血管中主要有內(nèi)皮細胞和其周圍的周細胞，目前的抗血管生成藥物主要針對內(nèi)皮細胞，比如Bevacizumab和Sunitinib等。研究表明，這些藥物在多種腫瘤中都取得了較好的治療效果。然而，在一些體積

2、較大的腫瘤中，這些藥就達不到理想的結(jié)果。這是因為針對內(nèi)皮細胞的治療會使微血管密度下降，但是血管的周細胞覆蓋率反而上升了。因此，周細胞也應(yīng)是抗血管生成治療的靶細胞。研究周細胞在血管中的作用對同時針對內(nèi)皮細胞和周細胞的抗血管生成治療具有重要的意義。
　　周細胞與內(nèi)皮細胞作用，能穩(wěn)定新形成的內(nèi)皮細胞小管，能調(diào)節(jié)血流和血管的通透性，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖、分化、遷移和存活。周細胞能分化為多種間質(zhì)細胞。如在血管增大過程中，周細胞可分化為血管平滑

3、肌細胞；在損傷修復(fù)及炎癥過程中，周細胞可從血管壁脫落，分化為能產(chǎn)生Ⅰ型膠原的纖維母細胞樣細胞；另外，有報道稱周細胞能分化為纖維母細胞，成骨細胞，軟骨細胞及脂肪細胞。周細胞的來源多樣，并且，在不同的組織器官，其來源也有區(qū)別。周細胞標(biāo)志物在不同的物種、不同的組織中會有不同，在不同的發(fā)育階段也會有差異。目前，可作為鑒定周細胞的標(biāo)記物主要有NG2、RGS5、PDGFRβ、desmin、α-SMA、3G5神經(jīng)節(jié)苷脂、Slug、XlacZ4及氨基肽

4、酶N等。眾所周知，腫瘤組織間質(zhì)與正常組織間質(zhì)明顯不同，這種不同也包含了腫瘤微血管周細胞。為了能更好地研究腫瘤微血管周細胞，需要一個能特異表達在其上的分子。而新近研究表明，CD248/Endosialin/TEM1是一個在腫瘤微血管周細胞上高表達的分子，而在正常組織微血管周細胞上并不表達。這就為更好研究腫瘤微血管周細胞提供了可能。
　　CD248是單次跨膜糖蛋白，已發(fā)現(xiàn)了四個與其作用的配體，分別是纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原及轉(zhuǎn)

5、移相關(guān)蛋白Mac-2BP/90K。在胚胎發(fā)育過程中，CD248表達在各種組織(肺、腎、脾、肝等)間質(zhì)纖維母細胞及血管上。并且，隨著胚胎的發(fā)育，CD248的表達逐漸下降。在成體組織中，CD248在子宮及腎小球中表達較高，輸卵管血管也有少量表達，心、肺表達更低，而其他組織則幾乎不表達。另外，在內(nèi)皮祖細胞中，也可見CD248表達。CD248在多種腫瘤中均有表達，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結(jié)腸癌等。
　　在本研究中，我們首先利用新鮮

6、標(biāo)本冰凍切片，進行兔抗人CD248抗體和鼠抗人CD31抗體及兔抗人CD248抗體和鼠抗人α-SMA抗體免疫熒光雙標(biāo)，證實CD248的確是膠質(zhì)瘤微血管周細胞特異表達的標(biāo)志物。其次，利用118例石蠟組織切片，研究CD248的表達在膠質(zhì)瘤中的臨床病理意義。為了更好研究CD248在腫瘤血管生成中的作用，我們利用CD248特異表達在腫瘤微血管周細胞上的特點，結(jié)合免疫磁珠的方法，分離膠質(zhì)瘤微血管周細胞，并經(jīng)免疫組織化學(xué)、免疫熒光和RT-PCR的方法

7、得到驗證。隨后利用慢病毒轉(zhuǎn)染CD248干擾序列到周細胞，經(jīng)免疫熒光、RT-PCR、Western blot的方法驗證干擾效果；用劃痕實驗及細胞增殖實驗觀察CD248對周細胞的影響。在周細胞CD248干擾前后對腫瘤血管生成的影響實驗中，把CD248干擾前后的周細胞分別與U87細胞混合后注入裸鼠皮下，觀察腫瘤大小及腫瘤血管生成情況。最終確認CD248為針對腫瘤微血管周細胞的抗血管生成治療的一個良好靶點。
　　主要結(jié)果:
　　一、

8、CD248特異表達在膠質(zhì)瘤微血管周細胞上，且其表達與患者性別、年齡無關(guān)，而與膠質(zhì)瘤的分級相關(guān)。在12例人腦原代膠質(zhì)瘤新鮮標(biāo)本中，對其中8例高表達CD248的標(biāo)本進行CD248和CD31及CD248和α-SMA免疫熒光雙標(biāo)染色。結(jié)果顯示，CD248表達在細胞膜上，CD31也表達在細胞膜上，但是兩者表達在不同的細胞上。CD248陽性細胞在CD31陽性細胞的周圍。α-SMA表達在細胞漿內(nèi)，它與CD248表達在相同的細胞上。由于CD31為內(nèi)皮細

9、胞標(biāo)記，而α-SMA為周細胞標(biāo)記，因此，上述結(jié)果表明：CD248表達在膠質(zhì)瘤微血管周細胞上，而不表達在微血管內(nèi)皮細胞上。因此，可以把CD248作為膠質(zhì)瘤微血管周細胞的一個特異性標(biāo)記分子。為了更好地了解CD248在膠質(zhì)瘤周細胞中的表達情況，我們對118例膠質(zhì)瘤標(biāo)本進行免疫組織化學(xué)檢測，發(fā)現(xiàn)WHOⅠ級6例均不表達，Ⅱ級39例中有15例表達(表達率38.46％)，Ⅲ級37例中有26例表達(表達率70.27％)、Ⅳ級36例中有27例表達(表達率

10、75％)。Ⅱ級膠質(zhì)瘤與Ⅰ級膠質(zhì)瘤相比，無顯著差異(P＞0.05)；Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤與Ⅰ級、Ⅱ級膠質(zhì)瘤相比，均有非常顯著差異(P＜0.01)；而Ⅲ級、Ⅳ級膠質(zhì)瘤之間CD248的表達無顯著差異(P＞0.05)。
　　二、成功分離、培養(yǎng)和鑒定了膠質(zhì)瘤微血管周細胞。我們運用兔抗人CD248多克隆抗體標(biāo)記膠質(zhì)瘤微血管周細胞，再運用免疫磁珠的方法，獲得了一群細胞。免疫組化染色結(jié)果顯示，這群細胞表達CD248，不表達內(nèi)皮標(biāo)記分子CD31及膠質(zhì)細

11、胞標(biāo)記GFAP。免疫熒光結(jié)果顯示，原代培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤中僅含有少量CD248陽性細胞，大部分為GFAP陽性的膠質(zhì)瘤細胞。免疫磁珠分離后所得到的細胞，大部分為CD248陽性細胞。在分離得到的細胞中，CD248與PDGFR-β共表達于細胞膜上，也與NG2共表達在細胞膜上。分離所得的周細胞純度為91.0±5.6％。RT-PCR結(jié)果顯示，分離所得細胞的條帶長度約為230bp，與預(yù)計的條帶吻合，即分離所得細胞含有CD248的mRNA。在ECM膠中，周

12、細胞能形成小管樣結(jié)構(gòu)；在三維支架中，周細胞能沿著膠原支架生長，形成小管結(jié)構(gòu)。
　　三、發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD248表達可抑制周細胞增殖和遷移。利用CD248shRNA慢病毒顆粒感染周細胞。免疫熒光染色顯示，與對照組相比，CD248shRNA干擾后的周細胞CD248表達明顯下調(diào)；RT-PCR結(jié)果顯示，CD248干擾后的周細胞mRNA大約下降了50％；Western blot結(jié)果表明，CD248干擾后的周細胞CD248的表達明顯下降。抑制CD2

13、48的功能后，周細胞的遷移能力明顯下降；干擾CD248分子在周細胞上的表達后，亦能明顯降低周細胞的遷移能力。細胞增殖實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，CD248干擾后，周細胞增殖能力明顯下降。
　　四、證實了CD248參與膠質(zhì)瘤移植瘤血管生成。下調(diào)周細胞CD248表達后，與U87細胞一起注入裸鼠皮下。結(jié)果顯示，與對照組相比，腫瘤體積縮小(P=0.022)，血管密度下降(P=0.021)，具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，但微血管直徑?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)意義(P

14、=0.769)。這說明CD248促進周細胞參與腫瘤血管生成?？赡軝C制為CD248與細胞外基質(zhì)中的纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原作用，促進周細胞增殖，使周細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶9，引起血管外基質(zhì)的降解，利于周細胞和內(nèi)皮細胞的遷移，進而形成更多的新生血管。
　　五、CD248活化后能促進周細胞招募相關(guān)受體的表達，推測其在周細胞上的作用與周細胞招募有關(guān)。轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白Mac-2BP/90K刺激對照組周細胞后，TGFRβⅠ，TGFRβⅡ，

15、PDGFRβ，EDG-1在mRNA水平上均有大幅上升，尤其是在刺激后12小時達到頂峰。而Mac-2BP/90K刺激CD248干擾后的周細胞后，TGFRβⅠ，TGFRβⅡ，EDG-1在mRNA水平上未見明顯升高，僅PDGFRβmRNA有一定的升高。周細胞的招募在腫瘤血管生成中具有重要作用，因此，CD248的激活，能促進腫瘤的血管生成。
　　上述結(jié)果表明，CD248在腫瘤中的高表達與腫瘤惡性程度有關(guān)，它具有促進腫瘤血管生成的作用，抑制