川芎嗪對(duì)H-,2-O-,2-誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的：研究川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)對(duì)過(guò)氧化氫(HydrogenDioxide，H2O2)誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。探討川芎嗪對(duì)冠心病(CoronaryHeartDisease，CHD)治療的可能機(jī)制。 方法：密度梯度離心法獲取臍血單個(gè)核細(xì)胞，添加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)誘導(dǎo)培養(yǎng)。每3d

2、更換一半培養(yǎng)液，添加VEGF、ECGS至原終濃度，細(xì)胞培養(yǎng)6d。收集貼壁細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡法觀察細(xì)胞吞噬ac-LDL和UEA-I-lectin內(nèi)皮細(xì)胞屬性，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表達(dá)CD34,CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的情況，體外成血管試劑matrigel觀察細(xì)胞成血管功能來(lái)鑒定EPCs。EPCs培養(yǎng)7d，收集貼壁細(xì)胞并分組為：正常對(duì)照組，TMP(5、25、100、200mg/L)組，H2O2(500μmol/L)

3、組，TMP(5、25、100、200mg/L)+H2O2(500μmol/L)組，繼續(xù)培養(yǎng)24h。在倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)EPCs形成梭形細(xì)胞數(shù)和重粘附細(xì)胞數(shù)，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖功能。 根據(jù)川芎嗪對(duì)H2O2誘導(dǎo)EPCs氧化應(yīng)激損傷，在梭形細(xì)胞形成、粘附、增殖功能方面的影響結(jié)果，可知25mg/LTMP對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷具有最佳的保護(hù)作用(見(jiàn)表1)。所以在檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)分組為：正常對(duì)照組、25mg/LTMP組、500μ

4、mol/LH2O2氧化應(yīng)激損傷組、25mg/LTMP+500μmol/LH2O2組。分別采用酶標(biāo)儀(CCK-8染色)、熒光顯微鏡(DAPI染色)、流式細(xì)胞儀(Annexin+PI染色)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率并以正常對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算凋亡比。用RT-PCR檢測(cè)各組bcl-2和bax的mRNA表達(dá)并計(jì)算bcl-2/bax比值。 結(jié)果： 1.內(nèi)皮祖細(xì)胞鑒定 貼壁培養(yǎng)3d，可見(jiàn)細(xì)胞集落形成；培養(yǎng)6d，絕大部分細(xì)胞分化為梭形細(xì)胞

5、；培養(yǎng)20d左右，可見(jiàn)細(xì)胞排列成條索狀。 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞雙染色結(jié)果表明，培養(yǎng)6d，細(xì)胞具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特性能吞噬ac-LDL和UEA-Ilectin。當(dāng)細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL時(shí)在綠光激發(fā)下發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞結(jié)合FITC-UEA-Ilectin在藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志CD34、CD133、VEGFR-2、VE-Cadherin的表達(dá)情況分別為：(78.51±5.53)％、(8.15

6、±4.45)％、(15.24±3.61)％及(64.48±6.56)％，CD34、VE-Cadherin雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(61.45±8.27)％，VEGFR-2、VE-Cadherin雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(6.13±0.78)％，CD34、CD133雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(6.21±0.68)％，(VEGFR-2)、CD133雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(5.63±0.72)％。 體外血管生成功能鑒定顯示，于倒置顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞拉長(zhǎng)變形，長(zhǎng)度為寬度

7、的4倍以上并可形成由梭形細(xì)胞圍成的多邊形管腔樣結(jié)構(gòu)，說(shuō)明細(xì)胞具有體外成血管的功能。 以上鑒定結(jié)果表明，從臍靜脈血分離獲取的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)VEGF、ECGS生長(zhǎng)因子向內(nèi)皮系誘導(dǎo)分化培養(yǎng)6d，細(xì)胞大多數(shù)為EPCs。 2.不同濃度的TMP對(duì)EPCs的干預(yù)培養(yǎng) 與正常對(duì)照組相比，TMP(5、25、100mg/L)組對(duì)臍血來(lái)源的EPCs梭形細(xì)胞形成、粘附、增殖功能有促進(jìn)趨勢(shì)但均無(wú)顯著影響(p＞0.05)，而200mg/LFM

8、P組卻顯著抑制EPCs功能，減少梭形細(xì)胞數(shù)，抑制細(xì)胞粘附、增殖(p＜0.01)。與H2O2氧化應(yīng)激損傷組相比，TMP(5、25、100mg/L)+H2O2組能顯著降低H2O2對(duì)EPCs梭形細(xì)胞形成、粘附、增殖功能的抑制(p＜0.05)。在增殖功能方面，與TMP(5、100mg/L)+H2O2組相比，25mg/LTMP+H2O2組具有最佳的保護(hù)作用(p＜0.05)；在梭形細(xì)胞形成、粘附功能這兩方面TMP(5、25、100mg/L)+H2O

9、2組各組間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 3.25mg/LTMP對(duì)H2O2誘導(dǎo)EPCs凋亡的保護(hù)作用 酶標(biāo)儀(CCK-8染色)、熒光顯微鏡(DAPI染色)、流式細(xì)胞儀(Annexin+PI染色)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：與正常對(duì)照組相比，TMP組有減少細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)，但無(wú)差異(p＞0.05)。與H2O5組相比，TMP+H2O2組能明顯減少細(xì)胞凋亡，組間凋亡比有顯著差異(p＜0.01)。 RT-PCR檢測(cè)bcl-2、baxmRN

10、A表達(dá)，計(jì)算bc-2/bax比值：與正常對(duì)照組相比，TMP組bcl-2、baxmRNA表達(dá)無(wú)差異(p＞0.05)。與H2O2組相比，TMP+H2O2組能顯著上調(diào)bcl-2、下調(diào)baxmRNA表達(dá)，提高bcl-2/bax的比值(p＜0.01)。 結(jié)論：(5、25、100mg/L)TMP對(duì)正常培養(yǎng)內(nèi)皮祖細(xì)胞梭形細(xì)胞數(shù)量和粘附、增殖功能有促進(jìn)趨勢(shì)但無(wú)明顯差異，但是200mg/LTMP明顯能抑制EPCs的梭形細(xì)胞形成、粘附、增殖功能：低

11、濃度尤其是25mg/LTMP對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有最強(qiáng)的保護(hù)作用，25mg/LTMP能明顯減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)bcl-2、下調(diào)bax的表達(dá)、提高bcl-2/bax的比值相關(guān)。 冠心病患者往往合并有一種或多種的CHD危險(xiǎn)因素，這些危險(xiǎn)因素可直接或間接的升高體內(nèi)氧化自由基水平，而氧化應(yīng)激損傷是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的惡性循環(huán)中的重要環(huán)節(jié)之一?；钛鏊幬颰MP，具有抗氧應(yīng)激損傷，保護(hù)細(xì)胞功能，減少細(xì)胞凋亡，可作