心肌營養(yǎng)素-1體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為心肌樣細胞的研究.pdf

1、研究背景：
　　 缺血性心臟病是全球高發(fā)的疾病之一，其本質(zhì)是心肌細胞的不可逆喪失。目前臨床積極進行溶栓，介入等再灌注治療，但仍缺乏針對已經(jīng)梗死心肌細胞再生的根本性治療方法，梗死心肌形成無收縮功能的瘢痕組織，導(dǎo)致心功能的改變，最終導(dǎo)致心衰。干細胞的發(fā)現(xiàn)與再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展為心肌細胞的再生帶來了新的希望。其中，成體骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)易于獲取、擴增，具有多分化潛能，且免疫

2、源性較低，甚至免疫抑制作用，是心肌細胞再生有前途的種子細胞。綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)作為活細胞的熒光標記，技術(shù)成熟，應(yīng)用廣泛。攜帶GFP的BMSCs轉(zhuǎn)染率高，熒光便于觀察，是體外活細胞示蹤的安全、高效的理想標記。近年來，以五氮雜胞苷(5-azacytidine，5-aza)為先驅(qū)和代表，將BMSCs誘導(dǎo)分化為有功能、乃至有電活動的心肌細胞的研究始終在進行。新的誘導(dǎo)劑大致分為如下幾類：①細

3、胞因子類，如血管內(nèi)皮生成因子，胰島素樣生長因子，肝細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子等；②炎性因子類如白介素-6，腎素，血管緊張素-Ⅰ，血管緊張素-Ⅱ等；③以及中醫(yī)藥類如黃芪甲甙，雙地龍，丹參酚酮，淫羊藿等。
　　 心肌營養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1，CT-1)是白介素-6細胞因子家族的一員，最早發(fā)現(xiàn)其促進細胞肥大的作用，在先天性心臟病、心肌病、進行性心力衰竭和心肌梗死等病理過程中均有過度表達。而CT-1誘導(dǎo)大鼠B

4、MSCs向心肌樣細胞分化的研究亦有進行，其結(jié)果提示：CT-1可輔助5-aza提高誘導(dǎo)率，但未能獨立將BMSCs誘導(dǎo)為心肌細胞。因此，本課題將研究CT-1在BMSCs誘導(dǎo)分化為心肌細胞中的作用，明確其誘導(dǎo)功效。
　　 研究目的：
　　 本研究旨在探索CT-1在誘導(dǎo)GFP轉(zhuǎn)染的小型豬BMSCs向心肌樣細胞分化中的作用，通過觀察分化過程中的形態(tài)學(xué)變化、研究其生物學(xué)活性及增殖能力、摸索適宜的誘導(dǎo)條件、檢測心肌細胞特異蛋白的表達，

5、以明確CT-1是否對BMSCs的誘導(dǎo)分化過程有作用，并為攜帶CT-1基因的BMSCs體內(nèi)移植并在體表達CT-1作為旁分泌因子刺激干細胞分化為心肌細胞提供理論和實驗依據(jù)，且為移植后在體細胞的生長分化情況及其改善心功能中作用的觀察提供實驗準備。
　　 研究方法：
　　 1、獲取、擴增穩(wěn)定的成體西藏小型豬BMSCs，繪制生長曲線，鑒定成脂、成骨潛能
　　 2、用攜帶GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染BMSCs，繪制生長曲線，鑒定成

6、脂潛能
　　 3、分組誘導(dǎo)分化
　　 將攜帶綠色熒光蛋白的MSC分為：空白對照組，5-aza組，CT-1組，復(fù)合組，換誘導(dǎo)液作用24小時后，繼續(xù)原條件培養(yǎng)28天。
　　 4、免疫熒光檢測以及計算熒光染色陽性率
　　 取誘導(dǎo)后28天的細胞加肌動蛋白(a-actin)，心肌肌鈣蛋白T(cardiac tropponinT，cTnT)一抗行免疫熒光染色，予羅丹明(Tetraethylrhodamine，TRIT

7、C)二抗，再行Hochest法染核。最后計數(shù)紅色熒光陽性染色率。
　　 5、統(tǒng)計分析：以SPSS13.0軟件統(tǒng)計，每組檢測結(jié)果以均數(shù)士標準差表示，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、BMSCs的培養(yǎng)與鑒定
　　 1.1原代BMSCs的培養(yǎng)與傳代
　　 一周后可見多個長梭形細胞集落，核圓居中，含1-3個核仁。約12天首次按2*10e4/cm2密度傳代。
　　 1.2

8、 BMSCs的成骨、成脂誘導(dǎo)
　　 取第四代細胞行成骨誘導(dǎo)21天后鈣化結(jié)節(jié)茜素紅染色陽性。成脂誘導(dǎo)14天行油紅O染色，胞核周圍紅染。
　　 2、慢病毒載體攜帶GFP基因轉(zhuǎn)染的BMSCs2.1取第四代細胞行GFP轉(zhuǎn)染，在熒光下觀察可見表達綠色熒光的細胞約60-80％，轉(zhuǎn)染后增殖速度較前變慢，2.2取第五代GFP-MSC進行成脂誘導(dǎo)，14天行油紅O染色，胞核周圍紅染。
　　 3、分組誘導(dǎo)
　　 21天起，可見

9、細胞生長減慢，細胞回縮變短，細胞聚集生長趨勢，細胞排列具有明顯的方向性，具有短棒狀結(jié)構(gòu)及位于中心的細胞核，核/漿比例明顯降低，未見細胞搏動。以復(fù)合組變化最為明顯。
　　 4、免疫熒光染色
　　 熒光顯微鏡下可見細胞核均顯示藍色熒光，約20％細胞顯示綠色熒光。
　　 a-actin紅色熒光染色結(jié)果顯示：復(fù)合組的誘導(dǎo)分化心肌樣細胞a-actin陽性率為29.900±4.7571％，明顯大于5-aza組(17.7333

10、±2.3459％，p=0.000)、CT-1組(6.6333±0.55076％,p=0.000)和空白對照組(1.6167±0.08505％，p=0.000)；5-aza組明顯大于CT-1組(p=0.000)和空白對照組(p=0.000)；CT-1組明顯大于空白對照組(p=0.028)。
　　 cTnT紅色熒光染色結(jié)果顯示：復(fù)合組的誘導(dǎo)分化心肌樣細胞cTnT陽性率為36.500±4.0927％，明顯大于5-aza組(14.366

11、±1.6502％，p=0.000)、CT-1組(7.5000±0.60828％,p=0.000)和空白對照組(1.1167±0.22546％，p=0.000)；5-aza組明顯大于CT-1組(p=0.000)和空白對照組(p=0.000)；CT-1組明顯大于空白對照組(p=0.003)
　　 結(jié)論：
　　 1.適宜濃度(10umol/l)的5-aza能夠在體外誘導(dǎo)攜帶GFP基因的BMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞，誘導(dǎo)后的細胞獲

12、得部分心肌細胞特異性蛋白的表達。2.適宜濃度(0.1ng/ml)的CT-1能夠在體外誘導(dǎo)攜帶GFP基因的BMSCs轉(zhuǎn)化為心肌樣細胞，誘導(dǎo)后的細胞獲得部分心肌細胞特異性蛋白的表達，但誘導(dǎo)率低于5-aza組。
　　 3.CT-1(0.1ng/ml濃度)與5-aza(10umol/l)復(fù)合提高誘導(dǎo)率。
　　 4.經(jīng)上述方案誘導(dǎo)后的細胞為心肌樣細胞，未見自主搏動。
　　 5.BMSCs體外培養(yǎng)傳至第六代后，經(jīng)28天貼壁培