細胞色素P450-2J3基因干預(yù)對果糖誘導(dǎo)胰島素抗合并高血壓大鼠生理指標的影響.pdf

1、第一部分高果糖誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗合并高血壓和高甘油三酯血癥 研究背景與目的：Hwang等首次報道高果糖飲食可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生高血壓。Zavarom和Tobey等研究發(fā)現(xiàn)，高果糖飲食也能引起大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗和高甘油三酯血癥。在確定果糖產(chǎn)生此效應(yīng)試驗中，35-72％果糖飲食或者飲用10-15％果糖溶液誘導(dǎo)大鼠兩周以上均可以產(chǎn)生胰島素抵抗合并高血壓，高甘油三酯血癥。本部分試驗主要在于使用高果糖飲食制作大鼠胰島素抵抗合并高血壓，高甘油三

2、酯血癥模型。 方法：雄性SD大鼠(30只)室溫馴養(yǎng)一周，隨機分為高果糖飲食組(12只)和正常飲食組(18只)。果糖飲食組食用標準飼料和飲用15％的果糖溶液，正常飲食組食用標準飼料和自來水。每周測量血壓一次，試驗組和對照組大鼠第三周采取尾靜脈血液并分離血清，留取大鼠24小時尿液。采用臨床標準方法測定血脂，血胰島素，血糖濃度。胰島素抵抗指數(shù)(IR)按內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)模型技術(shù)(HOMA)計算。各項指標采用SPSS統(tǒng)計軟件ANOVA統(tǒng)計分析，

3、參數(shù)以均數(shù)±標準差表示。 結(jié)果：果糖誘導(dǎo)3周后，果糖飲食組大鼠血壓明顯高于正常飲食組(135.5±0.6和119.4±0.7，P＜0.001)；果糖飲食組大鼠血胰島素及甘油三酯明顯升高，與正常飲食組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論：高果糖飲食可以引起大鼠胰島素抵抗和高血壓，高甘油三酯血癥。果糖誘導(dǎo)的大鼠代謝綜合癥是較為理想的代謝綜合癥動物模型之一。 第二部分CYP450-2J3基因的克隆及其在293細胞的

4、表達 研究背景與目的：花生四烯酸細胞色素P450(ArachidonicAcidCytochromeP450，CYP450)表氧化酶代謝產(chǎn)物表氧化二十碳三烯酸(EpoxyeicosatrienoicAcids，EETs)是繼一氧化氮(NO)和前列環(huán)素(PGI2)之后發(fā)現(xiàn)的又一種重要血管舒張因子。早期的研究發(fā)現(xiàn)，它通過激活鈣離子敏感的鉀通道，使平滑肌細胞處于超極化狀態(tài)而擴張血管，而被認為是內(nèi)皮源性超極化因子(Endothelium

5、-DerivedHyperpolaringFactor，EDHF)。內(nèi)皮來源的EETs也同樣可以激活K+Ca通道使平滑肌細胞超極化產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)，這種類似的效應(yīng)使研究人員懷疑EETs和EDHF是同一種物質(zhì)。花生四烯酸經(jīng)細胞色素P450(CytochromeP450，CYP450)表氧化酶代謝為四種EETs，分別為：5,6-EET、8,9-EET、11，12-EET和14,15-EET。細胞色素P450表氧化酶能夠以氧化和依賴NADPH

6、的方式氧化、過氧化和/或者還原膽固醇、維生素、類固醇與多種藥物。大鼠CYP2J3基因編碼的是分子量為57，969Da的末端含有亞鐵血紅素的細胞色素P450表氧化酶，屬于細胞色素P450超家族成員。這些細胞色素P450同工酶，如CYP2J2，CYP2J3能代謝花生四烯酸(arachidonicacid，AA)生成EETs。而這些化學物質(zhì)，在調(diào)節(jié)血壓，舒張血管，調(diào)節(jié)細胞增值，炎癥，參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面都起著重要作用。 我們采用RT-

7、PCR和OE-PCR技術(shù)成功克隆出CYP2J3基因，并將其亞克隆入pCDNA3.1(+)真核表達載體，pCDNA3.1(+)-CYP2J3重組質(zhì)粒的成功構(gòu)建，并在293細胞穩(wěn)定有效表達。為研究CYP2J3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。我們研究CYP450對于心血管系統(tǒng)保護的實驗研究在此基礎(chǔ)上進行。 方法：提取大鼠肝臟組織總RNA，采用RT-PCR擴增出CYP2J3基因兩個片斷CYP2J3-A和CYP2J3-B，運用重疊延伸聚合酶鏈

8、反應(yīng)(OE-PCR)擴增大鼠CYP2J3基因ORF全長，經(jīng)過酶切堅定和測序正確后，亞克隆入真核表達載體pCDNA3.1(+)。經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細胞，用WesternBlotting鑒定其在293細胞有效表達。 結(jié)果：RT-PCR成功克隆出CYP2J3-A和CYP2J3-B兩片段；運用重疊延伸PCR擴增出CYP2J3基因開放式閱讀框(ORF)全長序列，測序結(jié)果顯示獲得ORF全長序列；pCDNA3.1(+)-CYP2J3的成功構(gòu)建

9、，然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293細胞，試驗結(jié)果表明，CYP2J3基因能在293細胞穩(wěn)定有效表達。 結(jié)論：大鼠CYP2J3基因的成功克隆以及pCDNA3.1(+)-CYP2J3載體的成功構(gòu)建。為CYP2J3基因的功能研究和相關(guān)疾病的研究提供了可行的工具。 第三部分CYP2J3基因降低果糖誘導(dǎo)的大鼠高血壓并改善胰島素抵抗 研究背景與目的：最近的國內(nèi)外臨床觀察發(fā)現(xiàn)，高血壓患者常伴有胰島素抵抗甚至糖尿病，我們用高果糖溶液誘導(dǎo)出

10、了高血壓伴有胰島素抵抗的大鼠模型。實驗大鼠血壓較對照組明顯升高(135.5±0.6和119.4±0.7，P＜0.001)；而血甘油三酯和胰島素水平也顯著升高，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05)；實驗大鼠IR(HOMA)也明顯高于對照組(2.4±0.2和1.8±0.1，P＜0.05)；兩組血糖和膽固醇濃度無統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果顯示，高果糖誘導(dǎo)三周可以導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)明顯的血壓升高及高胰島素血癥，并產(chǎn)生胰島素抵抗。 最近的研究發(fā)現(xiàn)

11、，高果糖誘導(dǎo)動物模型的高血壓與交感神經(jīng)活性增加及內(nèi)皮素系統(tǒng)紊亂有關(guān)。EETs目前被認為就是一種EDHF，通過激活K+Ca通道使平滑肌細胞超極化產(chǎn)生血管舒張效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)血管張力降低血壓。有試驗表明，CYP2J3和CYP2J2都可以代謝花生四烯酸生成EETs，而EETs能舒張血管并降低大鼠血壓。這些結(jié)果表明內(nèi)源性和外源性的EETs水平影響著血管張力并與血壓的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本試驗主要探討CYP2J3基因干預(yù)能否降低高果糖誘導(dǎo)大鼠的高血壓，以

12、及高血壓大鼠的胰島素水平，從而改善胰島素抵抗。 方法：雄性SD大鼠飲用15％的果糖溶液誘導(dǎo)成高血壓和胰島素抵抗模型，經(jīng)尾靜脈注入pCDNA3.1-CYP2J3基因。大鼠血壓測量儀測量血壓，每周一次。果糖誘導(dǎo)第三周及基因注入后第二周分別留取大鼠尾靜脈血及24小時尿標本，采用臨床標準方法測定血脂，血胰島素，血糖濃度。胰島素抵抗指數(shù)(IR)按內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)模型技術(shù)(HOMA)計算。 結(jié)果：高果糖誘導(dǎo)三周后，試驗組大鼠血壓和胰島素均