弓形蟲P24基因敲除質粒的構建及缺陷型蟲株建立方法的初步研究.pdf

1、研究目的： 建立弓形蟲P24基因缺陷型蟲株，并對缺陷型蟲株建立的條件進行探索。 研究方法： (1)弓形蟲P24基因敲除轉染質粒pGB/P5-P3的構建根據(jù)TgP24基因序列，設計并合成兩對特異引物(P1 to P4)，采用PCR技術特異擴增TgP24基因的5'端非翻譯區(qū)2.5 kb片段(P245'UTR)和3'端非翻譯區(qū)2.89 kb片段(P24 3'UTR)，將其分別亞克隆入pCR2.1-TOPO TA載體。構

2、建質粒P24 5'UTR/TA和P243'UTR/TA；重組質粒P24 5'UTR/TA經(jīng)KpnⅠ和BglⅡ雙酶切后，再將純化的P24 5'UTR片段亞克隆入轉染質粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位點，構建重組質粒pGB-P5(GRA2/Ble-P24 5'UTR)；重組質粒P24 3'UTR/TA經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，純化P24 3'UTR片段，再將其定向克隆到重組質粒pGB-P5的BamHⅠ和NotⅠ位點。從而構建T

3、gP24基因敲除轉染質粒pGB/P5-P3。 (2)弓形蟲P24基因缺陷型蟲株篩選條件的建立采用微孔濾膜(孔徑為5.0um)過濾法純化弓形蟲速殖子；比較觀察電穿孔條件，如電轉染緩沖液，電壓，電容，脈沖次數(shù)對質粒轉染蟲株的影響。體外比較觀察不同宿主細胞(HFF，3T3和L929)對轉染蟲株藥物篩選的影響;比較觀察單獨細胞內藥物篩選和結合細胞外藥物低溫處理對蟲株篩選的影響(細胞中選擇培養(yǎng)10天左右，收集蟲體，4℃下福來霉素處理5天，

4、再回復到細胞內用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)約7天)。 (3)弓形蟲P24基因缺陷型蟲株的建立及鑒定分析應用優(yōu)化條件的電穿孔方法轉染RH株速殖子，以已建立的最佳篩選條件對蟲株進行篩選，將蟲株繼續(xù)在細胞中傳代培養(yǎng)(12hr)，高倍顯微鏡下，觀察納蟲泡的形成并計數(shù)，然后大量收集純化蟲株，用RT-PCR及Western-blot兩種方法對各組弓形蟲P24基因缺陷型蟲株的基因及其蛋白表達進行分析，并對蟲株的毒力變化進行了初步觀察。 研究結果：

5、 (1)弓形蟲TgP24基因敲除轉染質粒pGB/P5-P3經(jīng)過PCR篩選、限制性酶切及DNA測序鑒定，證實P24 5'UTR和P24 3'UTR兩片段正確插入質粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位點，位于藥物選擇ble基因的上，下游。 (2)顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)速殖子純度可達95％，濾膜過濾蟲體后，回收率也可達70％-80％；通過比較觀察發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化電穿孔條件后的弓形蟲存活率得到提高；采用將細胞內篩選和

6、細胞外藥物低溫處理相結合的方法對蟲株進行篩選較徹底；采用L929成纖維細胞做為轉染蟲株篩選的宿主細胞其易貼壁生長形成單層，個體較大，細胞傳代次數(shù)多，生長速度較慢，并且對篩選藥物的耐受力為三種細胞中最理想的。 (3)高倍顯微鏡下計數(shù)，12hr左右轉染蟲株在細胞中納蟲泡數(shù)為8個/hp，明顯低于RH速殖子形成的納蟲泡數(shù)19個/hp；獲得的轉染蟲株經(jīng)RT-PCR，Western-blot檢測，結果顯示L929細胞篩選組蟲株的基因及蛋白水

7、平均明顯低于HFF和NIH-3T3細胞篩選組蟲株：動物毒力試驗結果表明，L929細胞篩選組蟲株感染小鼠的平均存活時間長于對照組RH蟲株。 結論： (1)成功構建了弓形蟲P24基因敲除轉染質粒pGB/P5-P3，并且插入的靶基因兩端的片段較長，有利于提高同源重組效率。 (2)確定了弓形蟲電穿孔技術的應用條件以及TgP24基因敲除質粒轉染蟲株在不同哺乳動物細胞中的最佳篩選條件(采用細胞內篩選和細胞外藥物低溫處理相結合