DACH1對乳腺癌轉移的分子調控機理.pdf

1、近年來，乳腺癌已成為世界范圍內女性發(fā)病率及死亡率最高的癌癥，嚴重的影響了女性的健康和生活。大多數(shù)由乳腺癌引發(fā)的死亡是由轉移造成的。最近研究發(fā)現(xiàn)，上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的異常激活與乳腺癌惡性轉化及轉移聯(lián)系密切。然而，在這個過程中，涉及轉錄抑制的機制尚不明確。細胞命運決定因子DACH1(dachshund homolog1)是果蠅dachshund基因的同源物，在人類乳腺癌

2、、前列腺癌、子宮內膜癌和肺癌等癌癥的成瘤過程中起到了關鍵的調節(jié)作用。雖然發(fā)現(xiàn)DACH1能夠抑制癌基因誘導的乳腺癌細胞的侵襲和轉移，但是DACH1抑制乳腺癌轉移和EMT的分子機制在很大程度上仍是未知的。因此，本研究從DACH1的表達水平和EMT的相關性入手，探討了DACH1抑制鋅指蛋白SNAI1(zinc finger protein SNAI1)介導的EMT及乳腺癌轉移的分子調控機理。本論文的主要工作如下:
　　1.在本研究中，以

3、人類乳腺癌細胞系MCF-7、T47D和ZR-75-30細胞為實驗材料，通過相差顯微鏡成像，發(fā)現(xiàn)DACH1的表達水平與乳腺癌細胞的形態(tài)顯著相關。通過細胞克隆分散、細胞劃痕和侵襲小室實驗、免疫印跡和免疫熒光實驗證明，在ZR-75-30細胞中，過表達DACH1誘導細胞向上皮形態(tài)轉化、促進細胞間的粘連、上調上皮標志物E-cadherin和Cytokeratin18、下調間質標志物N-cadherin和Vimentin、并且抑制癌細胞的侵襲和遷移

4、;相反，在MCF-7和T47D細胞中，干涉DACH1誘導細胞向間質形態(tài)轉化、破壞細胞間的粘連、下調上皮標志物E-cadherin和Cytokeratin18、上調間質標志物N-cadherin和Vimentin、并且促進癌細胞的侵襲和遷移。因此，確定DACH1是EMT的負調控因子。
　　2.通過RT-PCR和熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)，DACH1能促進E-cadherin的轉錄，進而上調E-cadherin的mRNA水平。通過染色質

5、免疫共沉淀和熒光素酶報告基因實驗證明，DACH1以E-box依賴的方式激活E-cadherin的轉錄，并特異性的結合在E-cadherin的啟動子上。DACH1的DNA結合結構域(DBD)對DACH1介導的E-cadherin轉錄活性無影響，暗示存在其他因子介導DACH1與E-box的結合。
　　3.通過免疫共沉淀、哺乳動物雙雜交和GST-pulldown實驗證明，DACH1特異性的與SNAI1結合，而不與SNAI2結合。通過免疫

6、熒光實驗證明，DACH1能與SNAI1在細胞核內發(fā)生共定位。
　　4.通過連續(xù)染色質免疫共沉淀實驗證明，DACH1能與SNAI1形成復合物被招募到E-cadherin的啟動子上。通過染色質免疫共沉淀、免疫印跡和熒光素酶報告基因實驗證明，DACH1以SNAI1依賴的方式抑制乳腺癌細胞的侵襲及促進E-cadherin的表達。另外通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，DACH1能夠抑制HDAC1與SNAI1的相互作用，表明DACH1與SNAI1的結合

7、抑制了SNAI1招募HDAC1，有效地抑制了SNAI1的活性，最終激活E-cadherin的表達。
　　5.此外，在小鼠肺轉移模型實驗中，DACH1的水平也與轉移相關聯(lián)。DACH1顯著的抑制了BALB/c小鼠體內4T1/Luc細胞的肺轉移。通過免疫組織化學方法分析人類乳腺癌組織發(fā)現(xiàn)，DACH1與E-cadherin在SNAI1陽性的乳腺癌中顯著相關。
　　綜上所述，本論文揭示一種新的調控EMT及乳腺癌轉移的分子機制，即DAC