糖尿病大鼠肺泡巨噬細胞TLR4表達的研究.pdf

1、目的：
　　 TOLL樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是新近發(fā)現(xiàn)且備受關(guān)注的一種細胞跨膜受體及病原識別受體(pattern recognition receptors,PRR),在天然免疫中通過對病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)的識別發(fā)揮作用,是天然免疫和獲得性免疫的橋梁。近期TLRs信號傳導途徑在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中

2、所起的作用成為研究的熱點。實驗證實糖尿病患者單核細胞中TLR2,TLR4的表達增加,肺泡巨噬細胞在清除吸入性抗原及致病微生物方面等都具有重要的作用,故本實驗以肺泡巨噬細胞為研究對象觀察TLR4在正常大鼠及糖尿病4周,8周大鼠肺泡巨噬細胞表達的變化,探討糖尿病機體免疫防御能力變化的發(fā)生機制。
　　 材料與方法：
　　 1、動物模型制備及分組健康雄性Wistar大鼠24只,SPF級,鼠齡12周,體重(200±20)克,購于中

3、國醫(yī)科大學實驗動物室。隨機分為3組:正常對照組(A組,n=8),糖尿病4周組(B組,n=8),糖尿病8周組(C組,n=8)。糖尿病組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg體重,對照組注射同等劑量枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液,72小時后隨機血糖≥16.67mmol/L,為復制糖尿病模型成功。
　　 2、肺泡巨噬細胞的獲取與培養(yǎng)BALF離心后沉淀細胞加入含10％小牛血清、10萬單位/L青霉素、10萬單位/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液

4、,放入事先放有蓋玻片的60mm培養(yǎng)皿中,充分混勻后在37℃,5％CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2小時,使臣噬細胞貼壁,棄去非貼壁細胞。
　　 3、免疫細胞化學染色觀察TLR4在各組大鼠肺泡巨噬細胞表達的變化將貼有巨噬細胞的蓋玻片用4％多聚甲醛固定30分鐘,PBS洗片后采用免疫細胞化學染色SABC法染色。各組切片用Meta-Morph/DP10/BX41顯微圖像分析系統(tǒng)測定陽性細胞單位面積平均光密度值。
　　 4、統(tǒng)計分析

5、
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,實驗數(shù)據(jù)用(x)±s表示,各組間指標比較用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 免疫細胞化學染色結(jié)果正常組大鼠肺泡巨噬細胞可見弱的TLR4表達,以胞漿及胞膜為主呈較淡的棕黃色改變;糖尿病4周組細胞TLR4在上述部位的表達增多,在胞漿及胞膜呈會黃色改變;糖尿病8周組細胞的胞漿及胞膜呈深棕黃色改變,部分細胞胞核形態(tài)不規(guī)則。