多發(fā)性硬化的蛋白質組學和病理學研究.pdf

1、目的： 探索多發(fā)性硬化的分子機制并尋找該疾病腦脊液、血清的蛋白質標志物以及了解該蛋白質在EAE動物模型脊髓中的異常表達，探討其在MS的發(fā)病機制以及修復機制中的作用，為藥物療效觀察提供實驗資料。 方法： 1．緊張型頭痛患者腦脊液樣本經超濾濃縮并除鹽、以ProteoExtractAlbumin/IgG Removal Kit試劑盒去除高豐度蛋白，Bradford法測定蛋白質濃度，雙向凝膠電泳，硝酸銀染色以及考馬斯亮藍

2、染色，應用ImageMaster2DPlatinum5.0軟件分析凝膠圖譜圖像，尋找差異性蛋白點，與SWISS-2DPAGE數據庫進行比對，將感興趣的蛋白點切下，經膠內酶切，以肽質量指紋質譜技術鑒定，利用MASCOT軟件和NCBInr數據庫進行檢索并鑒定蛋白質。 2．按建立的腦脊液蛋白質組學研究技術體系，多發(fā)性硬化患者與緊張型頭痛患者各6例的腦脊液進行比較蛋白質組學研究。鑒定和分析差異性蛋白質點。 3．健康受試者血清樣本

3、經除鹽、去除高豐度蛋白，Bradford法測定蛋白質濃度，雙向凝膠電泳，硝酸銀染色以及考馬斯亮藍染色，應用ImageMaster2DPlatinum5.0軟件分析凝膠圖譜圖像，尋找差異性蛋白點，與SWISS-2DPAGE數據庫進行比對，將感興趣的蛋白點切下，經膠內酶切，以肽質量指紋質譜技術鑒定，利用MASCOT軟件和NCBInr數據庫進行檢索蛋白質。 4．按建立的血清蛋白質組學研究技術體系，多發(fā)性硬化患者與健康受試者各8例的血清

4、進行比較蛋白質組學研究。鑒定和分析差異性蛋白質點。 5．應用豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)加福氏完全佐劑皮下注射免疫Wistar大鼠，觀察其臨床癥狀以及病理學改變，建立EAE的Wistar大鼠動物模型。 6．EAE動物模型的各段脊髓經取材，包埋，切片，以二步法免疫組織化學染色，觀察APOE在各段脊髓灰白質內的表達；以SP法免疫組織化學染色，觀察膠質纖維酸性蛋白(GFAP)在各段脊髓灰白質內的表達。 結果：

5、1．硝酸銀染色：可檢測到316個蛋白質點；考馬斯亮藍染色：可檢測到201個蛋白質點；蛋白電泳凝膠的重復性研究，兩次銀染的匹配率為93.2％，通過對任選的30個匹配蛋白質點的pI值和MW值比較，結果無統(tǒng)計學差異，技術體系的重復性良好。 2.38種蛋白質的表達在多發(fā)性硬化患者與對照組顯著差異，部分差異性蛋白質經鑒定為白蛋白單體CRA_n、ATP合成酶、普通轉錄因子IIH、白蛋白單體CRA_j、四連接素、結合珠蛋白、叢生蛋白、富亮氨酸

6、α-2糖蛋白、視黃醇結合蛋白、甲狀腺結合蛋白。 3．硝酸銀染色：可檢測到233個蛋白質點；考馬斯亮藍染色：可檢測到168個蛋白質點；蛋白電泳凝膠的重復性研究，兩次銀染的匹配率為94.6％，通過對任選的30個匹配蛋白質點的pI值和MW值比較，結果無統(tǒng)計學差異，技術體系的重復性良好。 4.23種蛋白質的表達量在多發(fā)性硬化患者與對照組顯著差異，部分差異性蛋白質經鑒定為載脂蛋白E、絲氨酸蛋白酶抑制因子A1、白蛋白A鏈、a-1酸性

7、糖蛋白1、α-1微糖蛋白、叢生蛋白、結合珠蛋白、富亮氨酸α-2糖蛋白、視黃醇結合蛋白、甲狀腺結合蛋白。 5．EAE組發(fā)病率100％，發(fā)病時間為免疫后(14.1±2.6)天，呈慢性單相病程；HE染色見EAE組大腦、小腦、腦干以及脊髓組織大量炎性細胞浸潤，血管周圍形成炎細胞袖套，脊髓的病理改變嚴重，其中以白質與灰白質交界區(qū)域為著；Luxol fast blue染色見EAE組脊髓白質脫髓鞘改變。對照組無上述病理改變。 6．EA

8、E組炎性細胞聚集在血管周圍形成袖套樣改變，其血管周邊APOE免疫反應陽性明顯；對照組無上述病理改變。白質區(qū)域中的APOE免疫反應陽性細胞明顯多于對照組。灰質區(qū)域中的APOE免疫反應強于對照組。陰性對照均未見DAB染色。GFAP染色提示白質中APOE染色陽性細胞大部分來源于星形細胞。 結論： 多發(fā)性硬化患者腦脊液、血清中多種蛋白質表達差異，可能存在能量代謝異常、炎癥反應和組織修復機制；其中APOE在EAE中表達異常，反映星