骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備與對(duì)實(shí)驗(yàn)性重癥急性胰腺炎作用的研究.pdf

1、本課題以急性胰腺炎模型大鼠為研究對(duì)象,觀察急性胰腺炎病程中MSCs功能變化情況,進(jìn)而通過預(yù)先骨髓干預(yù)方法,研究骨髓功能狀態(tài)對(duì)SAP病情的影響,并給予SAP雌性模型大鼠輸注同種屬雄性來源MSCs,觀察移植MSCs在體“歸巢”、遷移、定植、分化情況,明確MSCs在急性胰腺炎組織損傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制。 第一部分 SAP和MAP動(dòng)物模型制作及評(píng)估 目的：制作SAP和MAP動(dòng)物模型,造模后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)胰腺炎相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo),初步

2、了解大鼠SAP模型病程規(guī)律,為下步實(shí)驗(yàn)選取關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)。 方法:SAP模型制作,雄性SD大鼠,體重250-300g。無菌條件下,以3％戊巴比妥鈉,按30mg/kg劑量腹腔注射麻醉并固定大鼠。于劍突下約3cm處腹壁正中,分層剪開皮毛、腹肌。循胃、十二指腸球及降部,暴露胰腺區(qū)域,找到主胰管,以24G靜脈套管針于主胰管對(duì)側(cè)腸壁刺入腸腔,稍退出針芯,循乳頭將軟套管穿入主胰膽管約0.5cm,動(dòng)脈夾固定,另于主胰膽管上游近肝門處動(dòng)脈夾鉗夾。3

3、％?；悄懰徕c溶液30mg/kg,以微泵12ml/h速度注入。注射后拔除套管針。為保證模型制作穩(wěn)定,將牛磺膽酸鈉溶液中加入美蘭溶液1滴,注射成功時(shí)可清晰顯示胰管走行,并且藍(lán)色溶液未漏入腸腔。輕癥急性胰腺炎(MAP)模型制作,雨蛙素20ug/kg,腹腔注射,間隔1h-次,連續(xù)4次,在第一次注射后12小時(shí)造模成功。對(duì)照組大鼠僅進(jìn)行假手術(shù)。在造模后0.5h、2h、4h、8h、12h、24h處死動(dòng)物,檢測(cè)血清淀粉酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、血肌酐,獲取

4、胰腺病理組織,依據(jù)schmidt評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。觀察72h三組動(dòng)物存活情況。 結(jié)論：雨蛙素腹腔注射和?；悄懰徕c胰管內(nèi)逆行注射分別可以誘導(dǎo)MAP和SAP動(dòng)物模型,方法成熟,模型穩(wěn)定。該SAP模型組織損傷嚴(yán)重,動(dòng)物死亡率高,適合作為胰腺炎治療研究對(duì)象,SAP 24h模型動(dòng)物胰腺病理損害最為嚴(yán)重,死亡率和病情達(dá)到高峰,在后面實(shí)驗(yàn)中,我們選擇24h為SAP模型主要觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)和干預(yù)治療時(shí)間點(diǎn)。 第二部分 MSCs原代、傳代培養(yǎng)及鑒

5、定 目的：原代培養(yǎng)并純化MSCs,根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物及其分化能力對(duì)MSCs進(jìn)行功能鑒定,為下步實(shí)驗(yàn)制備MSCs產(chǎn)品。 方法：無菌條件下,剪除大鼠雙側(cè)下肢,分離股骨,超凈臺(tái)上剪開骨端,10％胎牛反復(fù)沖洗髓腔至骨干發(fā)白,800rpm離心5分鐘,棄上清,按5×105/cm2密度接種于含10％胎牛的DMEM+F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。24h內(nèi)觀察細(xì)胞貼壁情況,此后每12h觀察細(xì)胞貼壁情況,待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板而積80％時(shí)傳代,根

6、據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況1:2,1:3傳代。首次傳代后繼續(xù)定期觀察,傳代。傳至第三代時(shí),胰酶消化,收獲細(xì)胞,并計(jì)數(shù)。分別進(jìn)行流式檢測(cè)和誘導(dǎo)分化研究。流式檢測(cè)方法,將收獲的MSCs分入5個(gè)離心管,每管約105細(xì)胞,分別為空白、CD29單標(biāo)管、CD44單標(biāo)管、CD45單標(biāo)管、mix管,各管內(nèi)加入相應(yīng)標(biāo)記抗體,避光孵育20分鐘后上機(jī)檢測(cè)。誘導(dǎo)分化方法,分別將P3代以上MSCs加入成骨、成脂、成軟骨體系貼壁培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)2周后行茜素紅染色,觀察鈣結(jié)節(jié)染色

7、,成脂誘導(dǎo)1周后行油紅染色,觀察脂肪顆粒染色,成軟骨誘導(dǎo)3周后行II型膠原免疫組化染色并觀察。對(duì)照組以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間后,按照同樣方法染色。 結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)建立了穩(wěn)定的MSCs原代、傳代培養(yǎng)方法。獲得的MSCs經(jīng)貼壁傳代培養(yǎng),純度達(dá)95％以上,流式鑒定結(jié)果顯示為L(zhǎng)in-CD29+CD44+-CD45-細(xì)胞群。通過對(duì)該細(xì)胞群進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化,結(jié)果顯示,MSCs可以向三系分化,為下部分實(shí)驗(yàn)提供了充足的MSCs產(chǎn)品。

8、第三部分 SAP時(shí)MSCs功能狀態(tài)分析 目的：分析SAP不同時(shí)間段內(nèi)MSCs功能狀態(tài)情況。 方法：胰管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c法制作SAP動(dòng)物模型(方法同第一部分),在造模后12h、24h、36h處死動(dòng)物,獲取動(dòng)物骨髓細(xì)胞,離心后棄上清,按105/cm2密度接種于含10％胎牛的DMEM+F12培養(yǎng)基的24孔板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24h內(nèi)觀察細(xì)胞貼壁情況,此后每12h觀察細(xì)胞貼壁情況,待細(xì)胞生長(zhǎng)至80％時(shí)傳代,根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況1:

9、2,1:3傳代。首次傳代后繼續(xù)定期觀察,傳代。傳至第三代時(shí),胰酶消化,收獲細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)(方法同第二部分)。平板克隆法計(jì)算克隆形成率,獲取動(dòng)物骨髓細(xì)胞,按105cm2密度接種于24孔板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),連續(xù)觀察,至出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落,棄除培養(yǎng)基,PBS沖洗,結(jié)晶紫染色10-15分鐘,流水沖洗,計(jì)算肉眼可見克隆集落數(shù)目。分化能力分析,P3代以上MSCs胰酶消化收獲后,分別加入成骨、成脂、成軟骨體系貼壁培養(yǎng),誘導(dǎo)分化(方法同第

10、二部分)。對(duì)照組大鼠未行胰腺炎造模,僅進(jìn)行假手術(shù),檢測(cè)分析方法同上。 結(jié)論：在SAP不同時(shí)間段,MSCs數(shù)量和增殖能力發(fā)生了改變,可能經(jīng)歷了先增加,再減少的過程。盡管MSCs增殖能力改變,SAP大鼠骨髓MSCs表面CD29、CD44、CD45表達(dá)無明顯變化。SAP時(shí)MSCs具有三系分化潛力。SAP病程對(duì)MSCs功能產(chǎn)生影響,增殖的MSCs可能參與了SAP病程。 第四部分 骨髓干預(yù)處理對(duì)SAP病情的影響 目的：觀察

11、骨髓動(dòng)員及骨髓抑制預(yù)處理對(duì)SAP病情的影響。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性SD大鼠,按照隨機(jī)數(shù)字法分入正常對(duì)照組、骨髓抑制組(busulfan)、骨髓動(dòng)員組(G-CSF)、SAP組、骨髓抑制-SAP組(busulfan-SAP),骨髓動(dòng)員-SAP組(G-CSF-SAP)。骨髓動(dòng)員處理以中性粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF),100μg/kg,腹腔內(nèi)注射,2h后胰管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c法制作骨髓動(dòng)員-SAP模型。骨髓抑制處理以白消安注射液,

12、1mg/100g,腹腔內(nèi)注射,6h后胰管內(nèi)逆行注射?；悄懰徕c法制作骨髓抑制-SAP模型。對(duì)照組為未進(jìn)行骨髓干預(yù)的健康SD大鼠。骨髓抑制組和骨髓動(dòng)員組在骨髓干預(yù)后2h,獲取動(dòng)物血液標(biāo)本,檢測(cè)血淀粉酶,制作血涂片,獲取胰腺組織標(biāo)本,HE染色后進(jìn)行病理評(píng)分,取雙側(cè)股骨,制作骨髓涂片。血涂片和骨髓涂片進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色,油鏡下觀測(cè),對(duì)有核細(xì)胞計(jì)數(shù)。骨髓干預(yù)-SAP模型在SAP造模后12h,處死動(dòng)物,檢測(cè)血清淀粉酶,獲取胰腺病理組織,依據(jù)sch

13、midt評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分。觀察72h三組動(dòng)物存活情況。 結(jié)論:G-CSF、白消安注射液分別能夠動(dòng)員或抑制大鼠骨髓MSCs。骨髓抑制-SAP組大鼠72h生存率顯著下降。提示MSCs功能狀態(tài)與SAP病情相關(guān),MSCs可能在SAP時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用,促進(jìn)損傷修復(fù)。 第五部分 同種異體MSCs移植對(duì)SAP的治療作用及其機(jī)制 目的：觀察MSCs移植對(duì)SAP的治療作用,進(jìn)而初步探討其機(jī)制。 方法：獲取雄性SD大鼠MSCs,

14、傳代培養(yǎng)(方法同第二部分)。制作雌性SD大鼠SAP動(dòng)物模型(方法同第一部分)。造模后24h輸注P3代以上MSCs,約5-7×107/只。輸注后24h處死動(dòng)物,獲取血液、骨髓、胰腺、肺臟、肘臟、脾臟、心臟、腎臟等病理標(biāo)本。MSCs在體鑒定,抽提臟器組織DNA,PCR法檢測(cè)Y染色體sry片段。MSCs熒光標(biāo)記在體鑒定,獲取MSCs細(xì)胞懸液,約107/ml,CFSE染液染色,37℃孵育5分鐘,熒光顯微鏡觀察后輸注SAP大鼠。輸注治療24h后獲

15、取上述標(biāo)本,血液標(biāo)本經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理,流式檢測(cè)CFSE陽性細(xì)胞。骨髓懸液熒光顯微鏡下觀察。組織標(biāo)本行HE染色或免疫組化染色后熒光顯微鏡下觀察。抽提胰腺組織、肺臟組織RNA,SYBERGREEN法相對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)TNF-α,IL-1βmRNA表達(dá)。免疫組化法檢測(cè)MSCs爬片標(biāo)本、SAP未輸注治療組胰腺病理切片、輸注治療后胰腺病理切片SHH抗原表達(dá)。輸注治療后胰腺病理切片免疫熒光檢測(cè)SHH、CFSE染色雙標(biāo)記陽性細(xì)胞,檢測(cè)CK

16、19、CFSE染色雙標(biāo)記陽性細(xì)胞。觀察輸注治療組和SAP未輸注治療組72h生存情況。 結(jié)論:MSCs移植治療可以降低SAP模型大鼠胰腺、肺臟TNF-α,IL-1βmRNA表達(dá)水平,提高SAP模型大鼠生存率。移植的MSCs可以“歸巢”至骨髓,遷移至胰腺炎癥損傷部位。貼壁培養(yǎng)MSCs和未經(jīng)治療的胰腺炎組織不表達(dá)SHH,輸注治療后,胰腺炎組織SHH表達(dá)陽性,并且存在SHH、CFSE陽性暈疊區(qū)域。提示SHH參與了MSCs遷移或分化過程。

17、 全文小結(jié)：本課題采用胰管內(nèi)注射?；悄懰徕c法,成功制作實(shí)驗(yàn)性SAP大鼠模型,通過對(duì)SAP病情指標(biāo)評(píng)估,確定24h為治療干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。應(yīng)用貼壁法,對(duì)正常狀態(tài)和SAP狀態(tài)MSCs進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)SAP不同階段MSCs數(shù)量和增殖能力經(jīng)歷了先升高再降低的過程。應(yīng)用骨髓干預(yù)措施改變MSCs功能狀態(tài),結(jié)果顯示MSCs抑制的SAP大鼠病情加重,死亡率提高,提示MSCs在SAP時(shí)可能發(fā)揮保護(hù)作用。進(jìn)而應(yīng)用同種異體MSCs移植治療SAP,提