β-catenin干涉質粒對膠質瘤細胞生物學效應影響的實驗研究.pdf

1、目的： 積極探索膠質瘤的發(fā)病機制，探索有效治療方法一直以來是神經(jīng)外科最重要，最熱點的研究課題之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)調控發(fā)育相關的信號通路與腦腫瘤的生長有密切關系。為了調節(jié)在腦腫瘤中異常表達的發(fā)育相關信號分子抑制腫瘤的生長，同時最大限度的降低對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害，有必要對發(fā)育相關的信號通路進行更加全面和深入的研究。Wnt信號通路在不同種屬的發(fā)育、細胞分化與增殖中起重要作用，而且發(fā)現(xiàn)它參與某些腫瘤的形成。Wnt/β-catenin信號

2、通路被認為是經(jīng)典的Wnt信號通路，異常Wnt信號通路致癌的關鍵是胞內游離的β-catenin蛋白積累并進入細胞核。β-catenin蛋白的聚集表達與腫瘤的侵襲，轉移和預后都有密切的關系。因此有學者認為針對Wnt信號通路的靶向治療可以抑制腫瘤的形成和生長。我們課題組前期收集94例各個級別的膠質瘤組織和6例正常腦組織通過免疫組化的方法研究發(fā)現(xiàn)β-catenin基因在膠質瘤中比正常腦組織中明顯表達增高，并且隨著膠質瘤級別增高而增高。因此我們認

3、為β-catenin是一個比較理想膠質瘤分子生物學標記和基因治療靶點。本研究擬運用RNA干涉技術構建靶向β-catenin基因的RNA干涉質粒，進一步對轉染人膠質瘤細胞U251中，對該基因在膠質瘤細胞的增殖過程中的影響進行深入研究，以期望為膠質瘤的診斷與治療提供一定的實驗依據(jù)和靶向治療途徑。 方法： 根據(jù)siRNA設計原則，通過軟件設計與參考相關文獻，選取含有19個核苷酸靶序列的一條反向重復序列，間以9個核苷酸的莖環(huán)序列

4、，兩端分別加上對應的酶切位點，形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表達載體pGPU6/GFP/Neo載體中，獲得靶向抑制β-catenin基因表達的干涉質粒。經(jīng)酶切、測序鑒定。用脂質體介導該干涉質粒轉染U251細胞，通過逆轉錄PCR、Western blotting方法檢測β-catenin基因mRNA、蛋白表達水平的表達情況，評價RNA干涉的效果。觀察轉染后細胞形態(tài)的變化，應用MTT法、流式細胞術初步評價轉染后對U251細胞的

5、生物學影響。 結果： 成功構建針對靶向β-catenin基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin RNA干涉質粒，經(jīng)酶切、測序鑒定為目的質粒。轉染人膠質瘤細胞U251后β-catenin干涉質粒有效的抑制了膠質瘤細胞中β-catenin基因mRNA水平、蛋白水平的表達。通過細胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)48小時以后胞核內出現(xiàn)一些空泡，隨時間增加細胞增殖變慢，死亡細胞逐漸增多，出現(xiàn)破碎、崩解等壞死表現(xiàn)，漂浮細胞及

6、細胞周圍碎片增多，呈明顯的時間依賴性。MTT提示轉染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質粒后細胞24小時、48小時和72小時后，各時間段轉染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質粒組與空白對照組和陰性對照組相比明顯受到抑制(P<0.01)。轉染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質粒組U251細胞的增殖隨著作用時間的延長，抑制率逐漸升高，且在作用72小時時抑制率較高，另

7、外空白對照組和陰性質粒轉染組比較無統(tǒng)計學差異。FCM檢測細胞凋亡顯示pGFP[Neo-shRNA-β-catenin質粒72小時后的U251細胞凋亡率與空白對照組和陰性質粒對照組比較明顯增高，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。FCM檢測細胞周期顯示轉染72小時后，轉染pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin質粒與空白對照組細胞周期變化差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞大多聚集在G0/G1期，而S期、G2/M期細胞數(shù)目

8、顯著下降，處于DNA復制和活動的細胞數(shù)目減少，U251細胞增殖受到抑制。 結論： 靶向β-catenin基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA-β-catenin RNA干涉質粒構建成功，并可特異性的沉默β-catenin基因的表達，初步證明了轉染β-catenin干涉質粒促進了細胞凋亡，抑制了細胞分化和增殖。膠質瘤惡性生長過程與Wnt信號通路β-catenin的激活有密切關系，β-catenin是一個比較理想膠質