眼針對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護作用及凋亡機制研究.pdf

1、目的及背景：缺血性腦血管疾病治療的關(guān)鍵在于挽救缺血半暗區(qū)瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。腦缺血再灌注損傷是指腦組織經(jīng)一定時間的缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)，使缺血性損傷進一步加重的病理現(xiàn)象。腦缺血損傷的機制十分復(fù)雜。腦缺血再灌注損傷缺血半暗區(qū)神經(jīng)元死亡的主要形式是細(xì)胞凋亡。眼針療法治療中風(fēng)療效肯定。積累了豐富的臨床經(jīng)驗，但作用機制研究尚不深入，本課題從抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)控細(xì)胞凋亡死亡受體通路信號傳導(dǎo)探討眼針對缺血再灌注損傷的保護作用機制

2、，揭示眼針治療缺血性中風(fēng)部分作用機制，更好為臨床治療中風(fēng)病提供科學(xué)依據(jù)。 方法：分組方法：將健康雄性SD大鼠240只隨機分為假手術(shù)組66只，模型組和眼針組各87只。每組又分成腦缺血再灌3h，24h，72h等時間點。 模型制作方法：參照Longa改良的線栓方法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。 試驗方法：眼針組取穴：上焦區(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)。刺法：用35×25mm毫針在相應(yīng)眼穴區(qū)距眶內(nèi)緣2mm處，平刺，由該區(qū)始點向

3、該區(qū)終點方向，刺入0.3cm，行捻轉(zhuǎn)手法，留針30分鐘，留針15分鐘時行針一次，持續(xù)時間1分鐘。針刺時機：再灌注即刻對動物神經(jīng)功能缺損評分，隨機分到模型組與眼針組，眼針組各時間點在缺血再灌注即刻及處死動物前針刺，動物存活期間每12小時針刺一次。假手術(shù)組及模型組不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)。 檢測方法及指標(biāo)：參照Longa.5分制評分標(biāo)準(zhǔn)評價神經(jīng)功能缺損癥狀評分；采用TTC染色測量梗死體積：光鏡及電鏡觀察缺血半暗帶腦組織病理改變及超微結(jié)

4、構(gòu)；應(yīng)用TUNEL法觀察缺血半暗區(qū)腦組織神經(jīng)元凋亡；采用免疫組化法檢測缺血半暗區(qū)腦組織Fax，F(xiàn)axl表達(dá)；采用RT-PCR法檢測缺血半暗區(qū)腦組織caspase-3，caspase-8mRNA蛋白表達(dá)；采用Elisa方法檢測缺血半暗區(qū)腦組織及血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法：所有實驗數(shù)據(jù)以均值土標(biāo)準(zhǔn)差(x土s)表示。所得數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析。 結(jié)果:

5、 1.眼針對神經(jīng)功能缺損癥狀評分的影響假手術(shù)組大鼠手術(shù)完成后，無神經(jīng)缺損體征出現(xiàn)。眼針組、模型組再灌注3h出現(xiàn)明顯神經(jīng)功能缺損。3h時間點，眼針組與模型組兩組間比較無顯著差異；24h、72h時間點眼針組與模型組兩組間比較有極顯著差異。 2、眼針對腦梗死體積的影響再灌注24h，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)有梗死病灶，模型組和眼針組梗死病灶主要位于右側(cè)額、顳、項葉皮質(zhì)及尾狀核、殼核區(qū)域。眼針組梗死體積顯著小于模型組。 3、眼針對缺血半暗帶

6、區(qū)神經(jīng)元病理改變及超微結(jié)構(gòu)的影響眼針治療組與模型組比較，腦組織形態(tài)有明顯改善。腫脹神經(jīng)元少見，細(xì)胞邊界清晰，核仁明顯。 電鏡觀察：眼針組半暗區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞可見較多線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體；與模型組比較明顯改善，與假手術(shù)組比較有輕微改變。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞較假手術(shù)組比較可見少量高爾基體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、核糖體，膠質(zhì)細(xì)胞基本正常。毛細(xì)血管內(nèi)皮光滑，基本正常。 4、眼針對缺血半暗區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響模型組及眼針組凋亡細(xì)胞于腦缺

7、血再灌注后3h開始增多，模型組、眼針組各時間點凋亡細(xì)胞與假手術(shù)組相比均有顯著性差異;眼針組與模型組比較，3h時間點，無顯著性差異，24h、72h時間點凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，有顯著性差異。 5、眼針對缺血半暗區(qū)神經(jīng)元FaxFaxl表達(dá)的影響免疫組化染色顯示：模型組、眼針組陽性目標(biāo)表達(dá)均于腦缺血再灌注后3h開始增加，各時間點模型組、眼針組與假手術(shù)組比較陽性細(xì)胞表達(dá)均有顯著性差異；眼針組與模型組比較，3h時間點陽性目標(biāo)表達(dá)無顯著性差異；

8、24h、72h時間點陽性目標(biāo)表達(dá)顯著減少，有顯著性差異。 6、眼針對缺血半暗帶區(qū)Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)的影響RT-PCR結(jié)果顯示各時間點假手術(shù)組Caspase-3，Caspase-8mRNA僅見微弱表達(dá)；各時間點模型組、眼針組與假手術(shù)組比較Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)有顯著差異；眼針組與模型組比較，3小時無顯著性差異；24小時、72小時有非常顯著性差異。 7、眼針對缺血半

9、暗區(qū)腦組織及血液腫瘤壞死因子(TNF-α)含量的影響缺血半暗帶區(qū)皮層腦組織中FNF-α含量，各時間點模型組、眼針組與假手術(shù)組比含量有非常顯著性差異。3小時時間點眼針組與模型組比較，無顯著性差異；24小時時間點有非常顯著性差異；72小時有顯著性差異。血液中TNF-α含量與腦組織中的含量趨勢基本相同。 結(jié)論: 1.改良線拴法制作腦缺血再灌注大鼠模型組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀及腦梗死病灶，證明模型成功。 2.中風(fēng)病的病位在

10、腦，與肝腎關(guān)系密切;眼針可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損.提示眼針可醒腦開竅，調(diào)臟腑虛實、通經(jīng)絡(luò)阻滯，因此提出：“眼絡(luò)于腦，通調(diào)臟腑”假說。 3.眼針可降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀評分，縮小腦梗死體積，改善缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元受損程度。 4.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，眼針可抑制缺血半暗帶區(qū)細(xì)胞凋亡。 5.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)Fax，F(xiàn)axl表達(dá)明顯增高；眼針可下調(diào)缺血半暗帶區(qū)F

11、ax，F(xiàn)axl表達(dá)。 6.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)明顯增高；眼針可下調(diào)缺血半暗帶區(qū)Caspase-3，Caspase-8mRNA表達(dá)。 7.腦缺血再灌注大鼠模型缺血半暗區(qū)腦組織及血液中腫瘤壞死因子(TNF-α)含量明顯升高，眼針可使其表達(dá)下調(diào)。 8.本課題揭示了眼針治療缺血性腦血管病可能是通過抑制凋亡信號傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞凋亡，挽救缺血半暗區(qū)，從而對腦缺血再