p53過表達對Ki-67基因核心啟動子活性的影響.pdf

1、目的：鑒定p53過表達對Ki-67基因核心啟動子活性的影響并探索其轉錄調控機制。
　　 方法：使用ICH和RT-PCR技術檢測p53對Ki-67基因表達的影響；雙熒光素酶活性檢測技術鑒定48小時內Ki-67基因核心啟動子活性變化趨勢以及p53過表達對其轉錄活性的影響；瞬時共轉染實驗檢測p53過表達對Sp1所介導的Ki-67基因核心啟動子活性上調的影響；ConTra啟動子同源性分析系統(tǒng)檢測Ki-67基因核心啟動子區(qū)潛在的轉錄因子結

2、合位點；定點突變技術分別構建p53結合模序和Sp1結合位點定點突變質粒；瞬時共轉染和雙熒光素酶活性檢測技術鑒定Ki-67基因核心啟動子區(qū)p53結合模序和Sp1結合位點在p53過表達所介導轉錄活性抑制中的作用。
　　 結果：p53過表達顯著抑制Ki-67基因的表達。48小時內Ki-67基因核心啟動子的活性表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，其中在24小時時達高峰。p53以劑量依賴的方式下調Ki-67基因核心啟動子的基本轉錄活性。ConTra

3、啟動子同源性分析系統(tǒng)在Ki-67基因核心啟動子區(qū)檢測到兩個p53結合模序。定點突變技術成功構建出3個p53結合模序突變質粒和3個Sp1結合位點突變質粒。p53結合模序突變后的Ki-67核心啟動子活性較突變前有所上調，但仍受p53的抑制。p53以劑量依賴的方式抑制Sp1介導的Ki-67基因核心啟動子活性的上調。隨著核心啟動子中Sp1突變位點數(shù)目的增加，Ki-67基因核心啟動子的基本轉錄活性顯著下降，而p53對其的抑制作用也相應減弱，當3個

4、Sp1結合位點全部突變后p53幾乎失去了對其的轉錄抑制活性；當核心啟動子區(qū)的第一個和第三個Sp1結合位點突變后，啟動子的轉錄活性較突變前有所上調。
　　 結論：p53過表達通過p53和Sp1依賴的途徑抑制Ki-67基因核心啟動子的基本轉錄活性，下調Ki-67基因的表達：1．p53通過與p53結合模序的序列特異性相互作用發(fā)揮對Ki-67基因核心啟動子的部分轉錄抑制活性；
　　 2．Ki-67基因核心啟動子區(qū)的第1個和第3個