雙功能siRNA對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)的抑制作用.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染嚴(yán)重影響人類的健康和生命安全,目前對(duì)慢性HBV感染者和攜帶者無(wú)特效治療方法。HBV基因組較小,易發(fā)生突變,限制了靶向病毒的抗病毒藥物研究。為了研究和開(kāi)發(fā)新型抗HBV藥物,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新型雙功能siRNA(5'-PPP-siRNA,3p-siRNA)核酸藥物,一方面通過(guò)刺激宿主細(xì)胞模式識(shí)別受體誘導(dǎo)宿主抗病毒Ⅰ型干擾素的表達(dá),同時(shí)通過(guò)RNAi作用特異性沉默HBV基因表達(dá)從而抑制

2、病毒復(fù)制。
　　 3p-siRNA結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencingcomplex,RISC),由RISC介導(dǎo)切割靶mRNA分子中與3p-siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域,從而達(dá)到沉默特異性基因表達(dá)作用;同時(shí),3p-siRNA可以活化維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retionic-acid-inducible genel,RIG-I),使RIG-I與位于線粒體外膜的銜接蛋白干擾素啟動(dòng)子刺激因

3、子-1(IFN-βpromoter stimulator-1,IPS-1)/CARDIF(CARD adaptor inducing IFN-β)/MAVS(mitochondrial antiviral signaling)/VISA(virus-induced signaling adapter)相互作用,下傳信號(hào),激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)或干擾素調(diào)節(jié)因子(interferonregul

4、atory factor-3,IRF3)等,誘導(dǎo)Ⅰ型IFN和促炎因子的表達(dá)和分泌,從而實(shí)現(xiàn)抑制HBV的目的。
　　 本研究首先通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄生成3p-siRNA。通過(guò)細(xì)胞毒性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在100nM,200nM時(shí)3p-siRNA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無(wú)顯著毒性,但是在500nM時(shí)3p-siRNA對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞具有一定毒性。研究發(fā)現(xiàn),將IFN-β熒光素酶報(bào)告基因與RIG-I共同轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,同時(shí)轉(zhuǎn)入海腎

5、蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因作為內(nèi)參,轉(zhuǎn)染24小時(shí)后將3p-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,16小時(shí)后檢測(cè)IFN-β熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)未轉(zhuǎn)染RIG-I時(shí)3p-siRNA只能微弱地誘導(dǎo)IFN表達(dá),但是共轉(zhuǎn)RIG-I后3p-siRNA顯著地誘導(dǎo)IFN表達(dá),說(shuō)明在HepG2.2.15細(xì)胞中3p-siRNA具有RIG-I依賴的激活宿主抗病毒天然免疫反應(yīng)。然而,我們用CIAP去除3p-siRNA5'末端的5'-ppp基團(tuán)后,將其與IFN-β熒光素酶報(bào)告基因和RIG-I

6、共同轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后,檢測(cè)IFN-β熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)經(jīng)CIAP處理的3p-siRNA并未激活RIG-I介導(dǎo)的IFN通路,說(shuō)明3p-siRNA誘導(dǎo)IFN表達(dá)主要是依賴于其5'末端的5'-ppp基團(tuán)。此外,3p-siRNA對(duì)干擾素刺激調(diào)控元件(ISRE)也具有RIG-I依賴的激活效應(yīng),在未共轉(zhuǎn)RIG-I時(shí)3p-siRNA微弱地誘導(dǎo)ISRE表達(dá),然而共轉(zhuǎn)RIG-I后3p-siRNA明顯地誘導(dǎo)ISRE表達(dá)。
　　 抗病毒活

7、性測(cè)定發(fā)現(xiàn),在HepG2.2.15細(xì)胞中,與siRNA抗HBV活性相比,3p-siRNA表現(xiàn)出更明顯的抗病毒活性。3p-siRNA轉(zhuǎn)染48小時(shí)后對(duì)HBsAg、HBeAg以及HBV DNA和HBV mRNA都有明顯的抑制效果。3p-siRNA對(duì)HBV具有持續(xù)的抑制效應(yīng),當(dāng)轉(zhuǎn)染3p-siRNA后48小時(shí)、96小時(shí)、144小時(shí),3p-siRNA對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制率分別是55％和41.8％、37％和24.3％、33.3％和14.8％

8、;當(dāng)共轉(zhuǎn)染RIG-I和3p-siRNA時(shí),3p-siRNA對(duì)HBAg和HBeAg的抑制率分別是66.3％和53％、55.5％和49.7％、45.6％和26.5％。與只轉(zhuǎn)染3p-siRNA相比,共轉(zhuǎn)染RIG-I時(shí)3p-siRNA對(duì)HBV表現(xiàn)出更明顯的抑制活性。以不同劑量(50nM、100nM、200nM)3p-siRNA轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)3p-siRNA對(duì)HBV的抑制作用呈明顯劑量依賴性。
　　 綜上所述,本研究成