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文檔簡介
1、家蠶的表皮覆蓋在其整個身體表面,參與了防止病原微生物的入侵、物理損傷、脫水等生理功能。表皮在家蠶發(fā)育過程中對其體形的塑造、維持正常活動能力是必不可少的,極大地增強了家蠶的生存和適應外界環(huán)境的能力。家蠶幾丁質結合蛋白作為表皮中重要的結構蛋白,參與了其蛻皮、變態(tài)發(fā)育等過程。幾丁質結合蛋白廣泛地存在于昆蟲表皮、圍食膜當中,它可以與幾丁質相互結合形成復合物,參與昆蟲表皮和圍食膜結構的形成。本研究主要通過生物信息分析、基因克隆、原核表達、West
2、ern Blot、免疫熒光、RNAi等方法對家蠶體內的幾丁質結合蛋白(BmCBP)進行鑒定,并對其在家蠶體內的分布及表達調控方式進行探究,為深入研究幾丁質結合蛋白在家蠶變態(tài)發(fā)育中的作用提供支持。
本研究主要內容包括:⑴對其中鑒定到兩個編碼幾丁質結合蛋白的基因,分別命名為 BmCBP1和BmCBP2,其中BmCBP1編碼237個氨基酸,成熟體大小約為26.4 kDa,等電點約利用已報道的含有ChtBD2結構域幾丁質結合蛋白氨基酸
3、序列檢索家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI數(shù)據(jù)庫,共鑒定到46個含有ChtBD2結構域的編碼蛋白,并分類命名為四個家族,分別包括26個圍食膜因子相似蛋白(CPAPs),13個圍食膜蛋白(PMPs),4個幾丁質酶(CHT)和3個幾丁質去乙酰化酶(CDA)。對各家族ChtBD2結構域進行同源性分析,發(fā)現(xiàn)均含有6個高度保守的半胱氨酸,且包含50到63個氨基酸殘基數(shù)不等,各家族的半胱氨酸的間隔數(shù)沒有明顯區(qū)別。對上述鑒定到的蛋白通過基因芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)
4、,該家族的組織表達模式可以分為2類,其中第Ⅰ類主要在頭部、表皮高量表達;第Ⅱ類主要在中腸高量表達。⑵為4.9;BmCBP2編碼227個氨基酸,成熟大小約為25.7 kDa,等電點約為4.6,兩者均含有三個富含半胱氨酸的ChtBD2結構域。進化分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1和BmCBP2可能在家蠶中存在較早的分化。對BmCBP1和 BmCBP2基因進行克隆、表達,對其表達形式分析發(fā)現(xiàn)BmCBP1主要以包涵體形式表達,BmCBP2的主要以可溶性形式表
5、達,進一步對可溶性表達的BmCBP2其進行純化,得到的高純度蛋白并制備多克隆抗體。效價檢測顯示BmCBP2的抗體效價高于1:512,000,濃度為1.60 mg/ml,抗體特異性檢測顯示BmCBP2的多克隆抗體可與抗原特異性結合,制備的抗體可用于后續(xù)實驗。⑶核酸水平檢測家蠶5齡第3天各組織以及各時期BmCBP1和BmCBP2的表達情況。RT-PCR及Q-PCR結果顯示,BmCBP1、BmCBP2均主要在頭部、表皮中表達量較高。時期表達特
6、征結果顯示,BmCBP1、BmCBP2主要在上蔟時期以及蛹末期高量表達。進一步在蛋白水平檢測BmCBP2家蠶預蛹期各組織及各時期表達,預蛹期各組織表達譜顯示BmCBP2主要在頭部、表皮中有高量表達,而時期表達特征結果顯示BmCBP2在眠期和變態(tài)發(fā)育期上調表達,蛋白水平Western Blot檢測結果基本與核酸水平相一致。通過蛻皮激素注射家蠶,Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)BmCBP2受到蛻皮激素的誘導上調表達。免疫熒光結果顯示,幾丁質主要定位在家蠶
7、體壁的表皮層,BmCBP2則存在于家蠶體壁的表皮層和皮細胞層。進一步通過免疫熒光對家蠶體壁4齡眠期不同時間點 BmCBP2蛋白和幾丁質定位發(fā)現(xiàn),BmCBP2蛋白參與家蠶4齡眠期新表皮的形成過程。⑷將可溶性的重組BmCBP2與幾丁質珠共同孵育,通過Western blot檢測,結果顯示BmCBP2蛋白能與幾丁質特異性結合,進一步驗證該蛋白與幾丁質互作,參與家蠶表皮的形成;構建了帶有 GST標簽的BmCBP2基因表達載體,利用GST-pul
8、l down對BmCBP2蛋白進行了體外互作蛋白的研究,經(jīng)質譜鑒定為CP8 precursor等蛋白,還需要進一步實驗驗證。當利用蛻皮液與BmCBP2蛋白共同孵育,發(fā)現(xiàn)蛻皮液中存在蛋白酶能夠特異性降解BmCBP2蛋白。通過RNAi干涉4齡眠期BmCBP2基因的表達,在核酸水平檢測成功下調BmCBP2基因的表達,然而在表型上并沒有明顯的變化,推測與BmCBP2基因在眠期持續(xù)性高表達有關,以上結果為進一步研究該蛋白的功能提供了重要研究線索。
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