miR-134對肝細胞癌的作用及其分子機制.pdf

1、[研究背景及目的]:
　　 肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的前列。近年來，雖然不斷有新的治療手段出現，但晚期肝癌的預后未能得到根本改變，臨床迫切需要尋找新的治療方案。
　　 肝細胞核因子4α(HNF4α)是一種細胞核激素受體家族的轉錄因子，在分化成熟的肝細胞中高表達，對肝細胞分化和維護肝細胞生物學功能發(fā)揮著重要轉錄調控作用。本

2、實驗室前期研究發(fā)現，HNF4α過表達腺病毒感染肝癌細胞株，可使肝癌細胞的腫瘤干細胞標志蛋白(CD90、CD133)下調，肝功能相關基因上調，發(fā)生“肝細胞樣”改變，肝癌細胞成瘤能力消失。體內研究表明，HNF4α可顯著抑制小鼠實驗性肝癌生長。
　　 HNF4α作為一種作用廣泛的核內轉錄因子，能夠被部分miRNA調控的同時，也能夠調控一部分miRNA。新近發(fā)現miR-629、miR-24可靶向負調控HNF4α表達，從而促進肝癌發(fā)生，而

3、HNF4α調控的miR-124可顯著抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展。本實驗室前期發(fā)現HNF4α能夠直接結合于人14號染色體印記基因Dlk1/Dio3區(qū)域上位點，對該區(qū)域中hsa-miR-379～hsa-miR-656 miRNA簇進行轉錄調控，并且過表達該區(qū)域上的miRNAs對腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲均有不同程度的抑制作用。miR-134是該區(qū)域中一個miRNAs。
　　 基于以上研究背景和前期實驗結果，本課題首先分析miR-134在肝

4、癌組織的表達及其與肝癌患者臨床惡性表型和預后的相關性，并探討miR-134對肝癌細胞的作用及其機制，為肝癌的診治提供新的靶點。
　　 [實驗方法]:
　　 一、miR-134在肝癌組織中的變化及其臨床意義
　　 1.腹腔注射二乙基亞硝胺（diethylinitrosamine，DEN）制備大鼠肝癌模型。分別取正常、11周、14周、17周、19周大鼠肝組織，用Real-time PCR的方法檢測DEN造模大鼠肝臟組

5、織中HNF4α及miR-134前前體(primary miR-134; pri-miR-134)的表達，并對兩者的表達相關性進行分析。
　　 2.利用Real-time PCR檢測臨床標本中肝癌/癌旁組織中pri-miR-134及HNF4α的差異表達，分析兩者表達的相關性，并從腫瘤大小、肝癌臨床分期、AFP、生存期等方面分析miR-134在肝癌組織中表達變化的臨床意義。
　　 二、miR-134抑制肝癌細胞生物學特性

6、r>　　 1.利用化學合成的miR-134擬似物(miR-134 mimic)上調肝癌細胞株YY-8103及LM3細胞中miR-134表達，或利用2'-甲氧修飾的miR-134互補鏈(as-miR-134)抑制肝癌細胞株miR-134的作用，通過CCK8（cell counting kit-8）檢測miR-134對肝癌細胞增殖能力的影響。
　　 2.YY-8103及LM3細胞轉染miR-134 mimic或as-miR-134

7、后，觀察miR-134對腫瘤細胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中克隆形成能力的影響。
　　 3.YY-8103及LM3細胞轉染miR-134 mimic或as-miR-134后，通過細胞遷移、侵襲實驗觀察miR-134對肝癌細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　 4.YY-8103細胞轉染miR-134 mimic后，檢測細胞周期及細胞凋亡。
　　 5.miR-134對肝癌細胞成瘤性的影響
　　 分別將感染表達miR-134的

8、腺病毒(Ad-miR-134)及對照病毒(Ad-GFP)的肝癌細胞YY-8103、LM3接種于裸鼠兩側腋窩皮下，定期觀察腫瘤生長情況并測量大小，觀察miR-134對肝癌細胞成瘤性的影響。
　　 6.miR-134對裸鼠皮下種植瘤生長的影響
　　 在裸鼠兩側腋窩皮下注射LM3細胞，每側2×106個細胞，待腫瘤長至50 mm3時（約10天），瘤內注射Ad-miR-134或Ad-GFP(2×109 pfu)，每周2次，觀察腫瘤

9、生長情況并測量腫瘤大小。3周左右處死裸鼠，取腫瘤組織稱重，測量大小，抽提組織RNA，Real-time PCR法檢測兩側腫瘤中miR-134的差異表達，免疫組織化學法檢測兩側腫瘤中Ki67及靶基因的表達情況，綜合評估上調miR-134表達對裸鼠皮下種植瘤模型的治療效果。
　　 三、確定miR-134的靶基因
　　 通過targetscan預測miR-134靶基因，在YY-8103肝癌細胞中轉染miR-134 mimic或

10、as-miR-134，通過Western Blot和Real-time PCR驗證miR-134的靶基因。進一步利用含有靶基因3'UTR的報告基因載體證實miR-134對其靶基因。共轉染不含3'UTR的靶基因過表達質粒及miR-134 mimic檢測YY-8103的增殖能力、軟瓊脂克隆形成能力、遷移及侵襲能力的變化，確定miR-134是否通過該靶基因發(fā)揮其生物學效應。
　　 四、miR-134在HNF4α抑制肝癌過程中的作用

11、r>　　 YY-8103細胞株感染HNF4α病毒上調HNF4α的同時，轉染as-miR-134下調miR-134，檢測肝癌細胞增殖、軟瓊脂克隆形成能力、遷移及侵襲能力的變化，并利用RT-PCR和Westem Blot檢測miR-134靶基因mRNA及蛋白水平。
　　 五、統(tǒng)計學分析
　　 數據采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行分析。方差齊性兩樣本資料采用兩樣本雙尾T檢驗;方差不齊的配對資料采用Wilcoxon符號秩檢驗

12、;方差不齊的不配對資料采用Mann-Whitney U檢驗;四格表資料采用x2檢驗;生存分析采用Kaplan-Meier分析;生存曲線采用log-rank檢驗;P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。
　　 [實驗結果]:
　　 一、miR-134在肝癌組織中的變化及其臨床意義
　　 檢測DEN誘發(fā)的大鼠實驗性肝癌模型不同時間點肝組織中HNF4α及pri-miR-134的表達變化，發(fā)現隨著造模時間的延長，肝臟HNF4α及p

13、ri-miR-134表達下調，并且HNF4α與pri-miR-134的表達變化呈線性相關。
　　 在71例臨床標本中，有63％(45/71)肝癌組織中HNF4α表達較癌旁組織下降，70％(50/71)肝癌組織中pri-miR-134表達下調。與HNF4α表達不下調的病例相比，在HNF4α表達下調的病例中pri-miR-134表達降低的更多，（HNF4α-high89％:HNF4α-low38％，P＜0.001），而且腫瘤組織pr

14、i-miR-134高表達的病例較pri-miR-134低表達的病例，腫瘤更小，合并肝硬化的比率小，處于TNMⅠ-Ⅱ期的比例高，有包膜包裹的病例數多（x2檢驗，P＜0.05）。
　　 二、miR-134抑制肝癌細胞生物學特性及其機制
　　 1.miR-134能夠抑制腫瘤生物學特性
　　 (1) miR-134抑制人肝癌細胞株增殖能力
　　 miR-134可降低肝癌細胞株YY-8103及LM3的增殖能力，而抑

15、制miR-134作用可顯著促進肝癌細胞株的增殖。
　　 (2) miR-134抑制人肝癌細胞株軟瓊脂克隆形成能力
　　 miR-134可以顯著抑制YY-8103及LM3細胞的軟瓊脂克隆形成能力，抑制率約為70％;反之，轉染as-miR-134后，肝癌細胞的克隆形成能力相比對照組明顯增強，最高可達1.5倍。
　　 (3) miR-134抑制人肝癌細胞遷移及侵襲能力
　　 YY-8103及LM3細胞轉染miR

16、-134 mimic后，細胞的遷移及侵襲能力受到抑制;而轉染as-miR-134后，肝癌細胞的遷移、侵襲能力明顯增強。
　　 (4) miR-134可使YY-8103細胞周期阻滯在G2/M期
　　 YY-8103中轉染miR-134 mimic48小時后流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示，相比對照組，miR-134能夠將細胞阻滯在G2/M期（117％，P＜0.01）。同時，AnnexinV-EGFP/PI雙染檢測細胞凋亡，

17、miR-134組與對照組無統(tǒng)計學差異。
　　 (5) miR-134能夠顯著抑制肝癌細胞的皮下成瘤能力
　　 皮下成瘤實驗結果顯示:YY-8103細胞感染AdGFP/AdmiR-134后接種于裸鼠皮下，18天時AdGFP組10只(100％)可觸及腫瘤，而18天時AdmiR-134組只有3只(30％)小鼠可觸及腫瘤生長，且腫瘤較AdGFP側小。LM3-AdGFP組接種11天后8只(80％)皮下可觸及腫瘤，19天后10只(1

18、00％)小鼠可觸及腫瘤生長，然而，AdmiR-134感染的LM3細胞接種10天后僅1只(10％)出現皮下腫瘤，25天時6只(60％)觸及皮下腫瘤，且相比AdGFP組，AdmiR-134組腫瘤體積較小。
　　 (6) miR-134抑制肝癌皮下種植瘤生長
　　 通過瘤內注射AdmiR-134/AdGFP，發(fā)現:在每個測量時間點Ad-miR-134注射組腫瘤體積均明顯小于Ad-GFP注射組。處死老鼠后取出腫瘤，Ad-miR-

19、134組腫瘤重量顯著輕于對照組。Real-time PCR結果顯示，與對照側相比，注射Ad-miR-134的腫瘤miR-134表達均有不同程度升高，免疫組化結果顯示AdmiR-134組增殖相關抗原Ki67陽性細胞比例減少。
　　 2.KRAS是miR-134的直接靶基因
　　 (1)在不同肝癌細胞株中，miR-134能夠下調KRAS mRNA及蛋白水平;而as-miR-134能夠上調KRAS mRNA及蛋白水平;

20、　　 (2)熒光素酶報告基因提示miR-134能夠下調KRAS3'UTR報告基因質粒表達，而突變KRAS3'UTR上結合位點則無法下調熒光素酶表達;
　　 (3)皮下種植瘤注射AdmiR-134組腫瘤相比對照組腫瘤，KRAS表達明顯降低。
　　 3.miR-134通過下調靶基因發(fā)揮其生物學功能
　　 過表達KRAS能夠減弱miR-134對YY-8103肝癌細胞的增殖、軟瓊脂克隆形成能力及細胞遷移、侵襲能力的抑制

21、作用。
　　 4.HNF4α通過上調miR-134逆轉腫瘤惡性進展
　　 as-miR-134能夠輕微下調HNF4α對YY-8103的增殖抑制作用，顯著降低HNF4α對腫瘤細胞軟瓊脂克隆形成能力、遷移和侵襲能力的抑制作用。此外，下調miR-134表達可抑制HNF4α對KRAS基因及蛋白表達的作用。
　　 [結論]:
　　 1.肝癌組織中miR-134表達與HNF4α呈顯著正相關，且與肝癌臨床惡性表型密切相