基于寡核苷酸芯片的地中海貧血特異性DNA甲基化的研究.pdf

1、地中海貧血是一組由于血紅蛋白的珠蛋白肽鏈(α、β、γ)的合成抑制、失衡,引起無效造血和溶血性貧血。目前,對于這類疾病尚無有效的治療方法,只能通過遺傳篩查及產前診斷選擇性的淘汰地貧患兒以控制這類疾病的發(fā)生和傳播。傳統(tǒng)診斷地中海貧血的方法實驗周期長,且只能診斷臨床上常見的幾種基因缺失或點突變所引起的地中海貧血。因此,迫切需要尋求一種新的具有組織特異性的分子靶標,為地中海貧血的診斷提供新途徑。
　　 目前,在應用于這種高度異質性遺傳病

2、的各種分子診斷方法中,快速簡便的基因芯片技術引人注目。因為,常規(guī)的基因和蛋白質組學的已不能滿足臨床的需要,尤其對于反復妊娠發(fā)病的或者輕型的地中海貧血患者而言,傳統(tǒng)的分子診斷方法不能檢測到基因突變或片段缺失,對于這部分病例,經典的遺傳學理論無法解釋其發(fā)病機制。表觀遺傳學的進展,為地中海貧血尋求和發(fā)現新的更簡便、更精確、易于推廣的診斷方法,提供了可能。
　　 表觀遺傳學是與遺傳學(genetic)相對應的概念,指的是基于非基因序列改

3、變所致的基因表達水平變化,如DNA甲基化和染色質構象變化等。從目前的研究來看,X染色體劑量補償、DNA甲基化、組蛋白密碼、基因組印記、表觀基因組學和人類表觀基因組計劃等問題都是表觀遺傳學研究的內容。有文獻報道,在任何時候,細胞內都有處于活化狀態(tài)的基因和失活狀態(tài)的基因。在發(fā)育過程的不同時期發(fā)生不同類型的基因轉錄。有關地中海貧血在表觀遺傳學甲基化修飾的研究雖有報道,但既不系統(tǒng)又未起到指導臨床診斷作用。隨著DNA甲基化檢測技術的發(fā)展和完善,通

4、過尋找受甲基化調控的新位點來診斷和治療疾病已經逐漸成為相關腫瘤和遺傳病的分子診斷和治療的手段之一。文獻報道,在珠蛋白基因轉錄、發(fā)育調控過程中,DNA甲基化起著關鍵作用。以分子雜交為基礎的微陣列技術應用于DNA甲基化檢測中,這種方法是基于雜交的寡核苷酸微陣列,是一種在基因組中尋找新位點的方法。通過這種高通量的方法,我們可以找到基因啟動子區(qū)高度甲基化的基因位點。目前為止,通過微陣列芯片技術檢測單基因遺傳病地中海貧血鮮有報道。受此啟發(fā),本研究

5、擬通過DMH甲基化芯片技術分析地中海貧血中相關分子的表觀遺傳學甲基化修飾規(guī)律和特點,以期能尋求和發(fā)現新的診斷地中海貧血的方法,提高地中海貧血的早期診斷率和篩查準確率,為臨床早期篩查和診斷地中海貧血胎兒開拓新途徑。
　　 本課題由三部分組成,即建立DNA甲基化芯片平臺;應用已成熟的基因表達譜芯片進一步篩選基因組地中海貧血新的位點,利用甲基化特異PCR(MSP)驗證芯片結果并探討甲基化差異位點與地中海貧血相關性;通過Sequenom

6、甲基化質譜測序平臺對IGSF4基因啟動子區(qū)測序,觀察IGSF4基因在地中海貧血中的甲基化狀態(tài),并探討其與地中海貧血發(fā)病機制的關系。
　　 主要結果如下:
　　 1.DNA甲基化芯片模型建立,DNA甲基化芯片數據處理系統(tǒng)完成。
　　 2.通過DMH芯片及其MAS系統(tǒng)的功能分類共發(fā)現11條與血液病及遺傳病直接相關的有甲基化變化基因,分別為CBFB、HDAC3、IL12A、PLAT、RTKN、RAD52、PTGS1、D

7、GUOK、MRE11A和THRA(ratio＞2.0)。
　　 3.基因LARP2、HDAC3、THRA在β-地中海貧血中呈高度甲基化狀態(tài)(ratio＞2.0),提示LARP2、HDAC3、THRA的高度甲基化可能成為表觀遺傳學上調控β-珠蛋白的機制之一。
　　 4.經MassARRAY甲基化質譜測序方法對23例地中海貧血和5例正常對照血樣對比分析,結果顯示,被檢測的IGSF4啟動子區(qū)12個CpG位點在地中海貧血中相對于

8、正常外周血甲基化程度明顯增高,呈高度甲基化狀態(tài)(P＜0.01),提示IGSF4基因的高度甲基化可能成為導致地中海貧血的機制之一。
　　 5.表達譜芯片數據分析結果顯示表達上調基因共有159個,下調基因共有92個。通過MAS系統(tǒng)分析得到與IGSF4途徑相關的基因位點CSF1、CSF2、TPO、HBB、HBD、HBA和CBLC與正常外周血相比呈表達下調(ratio＜0.50);CD45、AZU1和IL1B呈表達上調(ratio＞2.