晚期糖基化終末產(chǎn)物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌NO的影響及其機(jī)制探討.pdf

1、目的:
　　 以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫化學(xué)等方法觀察晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)在不同濃度和不同作用時(shí)間下對血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用。通過測定內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)、NOS活性、MDA含量、SOD活性及內(nèi)皮細(xì)胞DDAH2的表達(dá)情況,探討AGE對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌的影響及其機(jī)制。

2、r>　　 方法:
　　 取6-7代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)作為實(shí)驗(yàn)對象。實(shí)驗(yàn)分三組:AGEs組、HAS組,空白對照組(不加任何刺激因素)。AGE-HAS、HAS刺激終濃度為25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml,分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24、48小時(shí)后留取細(xì)胞培養(yǎng)上清液,收集后在-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用MTT法檢測AGE對內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的影響,然后應(yīng)用硝酸還原酶法、

3、黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸反應(yīng)法、NOS試劑盒分別檢測各組上清液中NO濃度、SOD活性、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、NOS活性,采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DDAH2的表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示,兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05即認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1：AGEs-HAS對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性的檢測

4、結(jié)果。
　　 1.1：AGEs組中用25ug/ml、50ug.ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/mlAGEs-HAS與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)后測得的細(xì)胞生長抑制率分別為:9.32±4.99％、16.76±4.09％、40.29±9.86％、51.27±12.41％、58.88±9.08％、40.29±9.86％。其中100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml三組對細(xì)胞的生長抑制率均顯著高于25ug/

5、ml、50 ug/ml兩組對細(xì)胞的生長抑制率,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.2：根據(jù)1.1所得結(jié)果將AGEs組分為低濃度(50ug/ml)、中濃度(100ug/ml)、高濃度(400ug/ml)三組分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24小時(shí)、48小時(shí)后測定其對內(nèi)皮細(xì)胞的生長抑制率,低濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抑制率分別為19.52±4.09％、24.61±2.65％,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中濃度組

6、在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抑制率分別為:40.29±9.86％、60.91±3.73％,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抑制率分別為:58.88±9.08％、75.28±2.00％,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2：AGEs-HAS對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO產(chǎn)生的影響；
　　 2.1：AGEs組中用25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、40

7、0ug/mlAGEs-HAS與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)后所測得細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO濃度分別為:81.70±4.08umol/l、65.36±9.27 umol/1、48.37±5.99umol/l、39.87±2.99umol/l、24.18±8.16 umol/1。與HAS組相比,AGEs在濃度為100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml時(shí)能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO的產(chǎn)生,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.2：

8、根據(jù)2.1所得結(jié)果將AGEs分為低濃度(50ug/ml)、中濃度(100ug/ml)、高濃度(400ug/ml)三組分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24小時(shí)、48小時(shí)后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的濃度,低濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NO濃度分別為:65.36±9.26 umol/1、32.68±2.99 umol/1,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NO濃度分別為:48.37±5.99 um

9、ol/l、22.22±6.30umol/1,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NO濃度分別為:24.18±8.16umol/l、7.840±3.92umol/l,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3：AGEs-HAS對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NOS產(chǎn)生的影響；
　　 3.1：AGEs組中用25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/mlAGEs-HA

10、S與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)后所測得細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NOS的活性分別為:0.82±0.03u/ml、0.65±0.09 u/ml、0.48±0.05 u/ml、0.39±0.02 u/ml、0.24±0.08 u/ml。與HAS組相比,AGEs在濃度為100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml時(shí)能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞NOS的活性,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.2：根據(jù)3.1所得結(jié)果將AGEs分為低濃度(50u

11、g/ml)、中濃度(100ug/ml)、高濃度(400ug/ml)三組分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24小時(shí)、48小時(shí)后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NOS的活性,低濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NOS活性分別為:0.65±0.09 u/ml、0.32±0.02 u/ml,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NOS活性分別為:0.48±0.05 u/ml、0.22±0.06u/ml,P＜0.05,差異有

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的NOS活性分別為:0.24±0.08u/ml、0.78±0.039u/ml,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4：AGEs-HAS對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞SOD活性的影響；
　　 4.1：AGEs組中以不同濃度(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的AGEs-HAS與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)后所測SOD活性分別為:30.8

13、5±1.48活力單位/ml、28.06±0.53u/ml、22.94±0.97u/ml、17.36±1.83u/ml、10.25±3.52u/ml。與HAS組相比,AGEs在濃度為25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml時(shí)均能夠明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞SOD的活性,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4.2：根據(jù)4.1所得的結(jié)果將AGEs組分為低濃度(50ug/ml)、中濃度(100ug/

14、ml)、高濃度(400ug/ml)三組分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24小時(shí)、48小時(shí)后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD的活性,低濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SOD的活性分別為:28.06±0.53 u/ml、24.02±1.55 u/ml,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SOD活性分別為:22.94±0.97 u/ml、21.54±1.59 u/ml,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;高濃度組

15、在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SOD活性分別為:、10.25±3.52 u/ml、11.95±1.36 u/ml,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5：AGEs-HAS對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MDA含量的影響；
　　 5.1:AGEs組中以不同濃度(25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml)的AGEs-HAS與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)后所測MDA濃度分別為:1.59±0.13n

16、mol/ml、1.82±0.17 nmol/ml、1.88±0.17nmol/ml、2.20±0.08nmol/ml、2.35±0.17nmol/ml。與HAS組相比,AGEs在濃度為25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml時(shí)均能夠明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞MDA的含量,P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.2:根據(jù)5.1所得的結(jié)果將AGEs組分為低濃度(50ug/ml)、中濃度(100u

17、g/ml)、高濃度(400ug/ml)三組分別與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞共同孵育24小時(shí)、48小時(shí)后測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA的含量,低濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MDA的含量分別為:1.82±0.17 nmol/ml、1.84±0.17 nmol/ml,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MDA的含量分別為:1.88±0.17 nmol/ml、1.90±0.17 nmol/l,P＞0.05,差異無

18、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。高濃度組在24小時(shí)、48小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的MDA的含量分別為:2.35±0.17nmol/ml、1.64±0.13nmol/ml,P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6:AGEs對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DDAH2含量的影響;
　　 6.1:用100ug/ml的AGEs-HAS刺激內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24、48小時(shí)后所測DDAH2的含量分別為:18282.29±1301.31、4466.02±2897.11。P＜0.05

19、,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.2:用100ug/ml的AGEs-HAS和AGES-HAS+RAGE刺激內(nèi)皮細(xì)胞共孵育24小時(shí)后所測DDAH2的含量分別為:18282.29±1301.31、5610.41±334.46。P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1:AGEs可抑制體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖活性,并呈一定的濃度和時(shí)間依賴性。
　　 2:AGEs對體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞N