鹿茸再生干細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、鹿茸是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能夠周期性再生的哺乳動(dòng)物器官，它的生長(zhǎng)速度極快卻沒有發(fā)生癌變。鹿茸再生的生物學(xué)研究對(duì)人類器官再生和腫瘤預(yù)防治療有重要意義。鹿茸再生是由角柄骨膜細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，角柄骨膜細(xì)胞是一種鹿茸再生干細(xì)胞。角柄骨膜包括致敏區(qū)和休眠區(qū)。正常生理?xiàng)l件下，角柄致敏區(qū)骨膜（Potentiated pedicle periosteum, PPP）能夠發(fā)育成完整的鹿茸組織，而角柄休眠區(qū)骨膜（Dormant pedicle periosteum

2、, DPP）則不能。因此，DPP和PPP的組織功能差異研究是揭開鹿茸再生之謎的重要途徑。細(xì)胞膜是保證細(xì)胞內(nèi)各生理活動(dòng)正常運(yùn)行的重要屏障，具有免疫應(yīng)答、粘附遷移、細(xì)胞識(shí)別以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要功能。對(duì)鹿茸再生干細(xì)胞膜蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行深入系統(tǒng)研究，必將為揭示鹿茸再生之謎提供有益線索。
　　為了研究DPP和PPP細(xì)胞差異表達(dá)膜蛋白，利用2D DIGE技術(shù)展開了以下試驗(yàn)：（1）用不同細(xì)胞獲取方法和純化方式進(jìn)行鹿茸再生干細(xì)胞膜蛋白的制備，對(duì)不同組

3、合方法進(jìn)行濃度測(cè)定和SDS-PAGE電泳并進(jìn)行結(jié)果分析；（2）進(jìn)行丙酮純化、2D Clean up kit純化和不純化三種方式的膜蛋白雙向電泳，對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果；（3）進(jìn)行梅花鹿DPP和PPP進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和膜蛋白提取，2D DIGE試驗(yàn)和質(zhì)譜鑒定；（4）對(duì)差異表達(dá)膜蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)6個(gè)鑒定的差異表達(dá)膜蛋白進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果顯示：（1）細(xì)胞刮法獲取鹿茸再生干細(xì)胞優(yōu)于胰酶消化法，2D Clean up kit純

4、化處理的膜蛋白雙向電泳圖最優(yōu)，丙酮次之，不純化效果最差；（2）細(xì)胞刮取結(jié)合2D Clean up kit純化處理進(jìn)行鹿茸再生干細(xì)胞膜蛋白雙向電泳獲得了理想的圖譜；（3）通過鹿茸再生干細(xì)胞膜蛋白的2D DIGE分析，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05，差異倍比≥1.2）的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)122個(gè)，最終鑒定出53個(gè)可用的膜蛋白。其中有17個(gè)膜蛋白在PPP細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，36個(gè)膜蛋白在PPP細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)；（4）驗(yàn)證結(jié)果顯示，HSPB1、FTL、SEP

5、T11、VCL、RUVBL2和PHGDH的qRT–PCR結(jié)果與2D DIGE結(jié)果相一致，證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　得出以下結(jié)論：（1）獲得了優(yōu)良的鹿茸再生干細(xì)胞膜蛋白組表達(dá)圖譜，包含3398個(gè)蛋白點(diǎn)；（2）具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05，差異倍比≥1.2）的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)122個(gè)，最終鑒定出53個(gè)可用的膜蛋白，按功能分類主要有催化活性、結(jié)合、結(jié)構(gòu)分子、載體轉(zhuǎn)運(yùn)和酶調(diào)節(jié)等；（3）與 DPP相比，在PPP細(xì)胞中有17個(gè)膜蛋白上調(diào)表達(dá)，可