LOX-1在低氧誘導肺動脈高壓肺血管重構中的作用及機制.pdf

1、第一章 LOX-1介導低氧誘導肺動脈高壓肺血管重構
　　研究背景: 肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)表現為靜息時平均肺動脈壓大于25 mmHg或運動時大于30 mmHg，肺血管阻力大于3 Wood單位。
　　PAH的主要病因是肺小動脈原發(fā)病變而導致肺動脈阻力增加，最終可導致患者右心衰竭而死亡。業(yè)已證明，PAH時肺動脈阻力增高的主要原因是肺血管重構導致肺動脈腔隙狹窄，而肺動脈

2、平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的過度增殖是引起血管重構的關鍵因素。
　　凝集素樣氧化性低密度脂蛋白受體-1（lectin-like oxidized lowdensity lipoprotein recepter-1，LOX-1）在多種心血管疾?。ò▌用}粥樣硬化和高血壓心血管重構）的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用。LOX-1通過氧化應激和促炎機制損傷血管內皮細胞，

3、促進心肌細胞和血管平滑肌細胞增殖從而介導心臟、胸主動脈和腎血管重構。最新研究發(fā)現，LOX-1在培養(yǎng)的慢性栓塞性肺動脈高壓患者PASMCs中表達增加，可能介導C反應蛋白所誘導的PASMCs增殖。但LOX-1在低氧PAH血管重構中的作用及機制目前仍不清楚。因此，本研究擬在低氧誘導的PAH大鼠模型及原代PASMCs模型，探討LOX-1是否介導低氧誘導PAH肺血管重構，并進一步探討該作用是否與其促PASMCs增殖有關。
　　方法: (1)

4、在體實驗:180～220 g SD大鼠，采用低氧倉(10％ O2)飼養(yǎng)3周誘導低氧PAH大鼠模型。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+IS)并稱重，計算RV/(LV+IS)比值。ELISA法檢測大鼠血漿中sLOX-1水平;提取肺動脈總RNA或蛋白，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表達;4％多

5、聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，進行HE染色或LOX-1免疫組化染色。(2)細胞實驗:大鼠原代PASMCs采用組織塊貼壁法制備，取第3代細胞進行α-actin免疫組化鑒定細胞。3-6代用于后續(xù)實驗。低氧(3％O2)刺激細胞增殖。(3) LOX-1中和抗體實驗:采用不同濃度LOX-1中和抗體(5、10、20 ng/ml)預孵育1h，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表達，流

6、式細胞術檢測細胞周期，MTS檢測細胞增殖情況。(4) LOX-1小分子RNA干擾(siRNA)實驗:當PASMCs達到60％～70％融合后，采用TurboFect轉染試劑將LOX-1 siRNA干擾片段瞬時轉入細胞，干擾LOX-1表達，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1 mRNA或蛋白表達變化評價不同片段的干擾效率，選擇最佳干擾片段及適當的濃度用于后續(xù)實驗。LOX-1 siRNA干擾24 h后低氧處理細胞

7、。Real-Time PCR或Western Blot檢測Ki-67，PCNA mRNA或蛋白表達，流式細胞術檢測細胞周期，MTS檢測細胞增殖情況。
　　結果: 1.低氧誘導PAH大鼠的RVSP、mPAP較常氧對照組顯著升高，RV/(LV+IS)顯著增加，右心室明顯增厚，肺動脈顯著重構， Ki-67及PCNA mRNA表達顯著增加。2.低氧誘導PAH大鼠血漿中sLOX-1水平顯著高于常氧對照組;PAH肺動脈主干部位LOX-1mRN

8、A和蛋白表達顯著增加;免疫組化顯示肺小動脈LOX-1蛋白表達也顯著增加。3.低氧可促進PASMCs增殖，同時可誘導LOX-1表達;LOX-1中和抗體(TS-20)及LOX-1 siRNA可顯著抑制低氧引起的細胞增殖。
　　結論: LOX-1介導低氧誘導的肺動脈平滑肌細胞增殖，參與低氧肺動脈高壓肺血管重構。
　　第二章低氧促肺動脈平滑肌細胞中LOX-1表達上調的上游機制
　　研究背景: LOX-1是一種多配體受體，許多因

9、素可以導致LOX-1表達上調。我們第一章研究發(fā)現在低氧PAH時，低氧可顯著上調PASMCs中LOX-1表達。但是具體機制仍不清楚。
　　最新研究發(fā)現，microRNA-let-7g可抑制其靶基因LOX-1的表達。于是，我們推測低氧上調LOX-1表達也許通過下調let-7g表達而引起。LOX-1激活后可促進下游靶基因OCT-1與let-7g的啟動子區(qū)域結合。OCT-1是一個翻譯抑制因子，可以和let-7g啟動子區(qū)域靶向結合后抑制le

10、t-7g的表達。因此，我們推測LOX-1可能通過上調OCT-1進而抑制let-7g的表達從而進一步上調LOX-1本身的表達水平。
　　Calpain是一種非溶酶體Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶，可以被Ca2+信號途徑激活，并選擇性地解阮靶蛋白從而控制細胞功能如細胞骨架重構、細胞周期生長、基因表達和細胞凋亡。最新研究表明，calpain抑制劑MDL287170可明顯抑制野百合堿誘導的大鼠PAH時肺血管重構。已知LOX-1可通過激活細胞

11、內Ca2+從而上調PKC的表達，進一步上調OCT-1的表達。同時，calpain也可通過部分解阮作用導致靶蛋白PKC激活。因此，我們推測低氧PAH時，LOX-1可能通過LOX-1-calpains-PKC-OCT-1-let-7g-LOX-1途徑來實現反饋調節(jié)。
　　方法: (1)在體實驗:180～220 g SD大鼠，采用低氧倉(10％ O2)飼養(yǎng)3周誘導低氧PAH大鼠模型。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈

12、壓(mPAP)。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+IS)并稱重，計算RV/(LV+IS)比值，以確定造模成功。提取肺動脈總RNA或蛋白，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7g mRNA或蛋白的表達;(2)細胞實驗:大鼠原代PASMCs采用組織塊貼壁法制備，取第3代細胞進行α-actin免疫組化鑒定細胞。3-6代用于后

13、續(xù)實驗。低氧(3％O2)刺激細胞增殖;(3) Let-7g過表達實驗:采用let-7g mimic瞬時轉染法。當PASMCs達到70％～80％融合后，采用TurboFect轉染試劑分別將let-7g mimic瞬時轉入細胞。Real-TimePCR檢測let-7g mRNA表達以確定轉染效率，選擇最佳濃度用于后續(xù)實驗。PASMCs轉染let-7g mimic24 h后低氧處理，real-time PCR或Western Blot檢測LO

14、X-1、Ki-67、PCNA mRNA或蛋白表達，流式細胞術檢測細胞周期，MTS檢測細胞增殖情況;(4) PKC、LOX-1抑制實驗:采用不同濃度LOX-1中和抗體(5、10、20 ng/ml)或PKC抑制劑白屈菜紅堿(1μM)預孵育PASMCs1 h后低氧處理，real-timePCR或Western Blot檢測LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7gmRNA或蛋白表達;(5)

15、 LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1抑制實驗:采用小分子RNA干擾(siRNA)法。當PASMCs達到60％～70％融合后，采用TurboFect轉染試劑分別將以上基因的siRNA干擾片段瞬時轉入細胞，干擾相應基因表達， real-Time PCR或Western Blot檢測相應基因mRNA或蛋白表達變化評價不同片段的轉染效率，選擇最佳干擾片段及適當濃度用于后續(xù)實驗。siRNAs干擾24

16、 h后低氧處理細胞，real-time PCR或Western Blot檢測LOX-1、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1、let-7g mRNA或蛋白表達。
　　結果: 1.低氧誘導PAH大鼠肺動脈及低氧誘導PASMCs中l(wèi)et-7gmRNA表達顯著降低，let-7g mimic可顯著降低低氧誘導的PASMCs增殖，同時也可顯著抑制低氧誘導的LOX-1表達上調;2.抑制LOX-1可顯著逆轉低氧

17、引起的let-7g表達下調，LOX-1與let-7g之間存在著反饋調節(jié);3.低氧誘導PAH大鼠肺動脈及低氧誘導PASMCs中calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表達顯著增加，抑制PKC、calpain-1、calpain-2、calpain-4、OCT-1表達后可顯著逆轉低氧引起的let-7g表達下調及LOX-1表達上調;4.抑制LOX-1表達后可抑制低氧引起的calpain-1、calpain-2、c

18、alpain-4、OCT-1表達上調，這些基因均參與了LOX-1-let-7g的反饋調節(jié)。
　　[結論]低氧PAH時，低氧引起PASMCs中LOX-1表達上調的上游機制為LOX-1-calpains-PKC-OCT-1-let-7g-LOX-1反饋調節(jié)通路。
　　第三章低氧肺動脈高壓時LOX-1促肺動脈平滑肌細胞增殖的下游機制
　　研究背景: 血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，V

19、SMCs)表型具有多樣性和可變性的特點。在胚胎發(fā)育過程中，VSMCs由未分化表型逐漸分化為具有成年特征的分化表型。當血管受到損傷或體外培養(yǎng)的VSMCs受到生長因子刺激時，VSMCs又從分化型轉化為去分化型，表現為平滑肌標志基因表達下調，合成和分泌能力增強，重新獲得增殖和遷移能力，導致血管壁增厚、管腔狹窄、血管順應性降低和血管重構等。大多數平滑肌標志基因中存在一系列稱為CArG盒的順式調控元件。研究證明，CArG盒元件與血清反應因子(se

20、rumresponse factor，SRF)的結合對許多心肌、血管平滑肌和骨骼肌特異表達基因起重要的調節(jié)作用。但同時CArG序列作為血清反應元件(serum response element，SRE)的核心成分也是許多即刻早期反應基因（如c-fos和egr-1）表達所必須的順式元件。因此，SRF除可激活平滑肌特異性基因外，還與細胞增殖有關。
　　有研究發(fā)現，兩條主要的信號通路可導致共轉錄因子和SRF結合而發(fā)揮基因表達調控作用。經

21、典的通路是生長因子刺激使MAPK信號通路激活后導致SRF共轉錄因子Elk的磷酸化，最后導致細胞增殖相關基因的表達。第二條調節(jié)通路是由Rho依賴性的肌動蛋白動態(tài)改變。研究表明，通過生長因子刺激可以抑制VSMCs分化，并且同時可以發(fā)現由于生長因子依賴性的三元復合體因子(ternarycomplex factors，TCFs)存在，使myocardin從SRF中脫離出來。血管損傷或細胞增殖時，Elk可作為一個使myocardin從SRF中置換

22、出來的VSMCs特異基因表達的信號抑制因子。因此，VSMCs增殖可通過以下兩條途徑實現:一條是通過MAPK通路導致TCF的磷酸化，而另一條是依賴于抑制MRTFs家族與SRF結合。
　　如前所述，LOX-1可促進VSMCs和PASMCs增殖，但其促PASMCs增殖的機制尚不清楚。已知LOX-1激活后可導致下游通路的激活，其中包括:NADPH氧化酶、MAPKs(p38，ERK1/2，JNK)、PKC等。于是，我們推測在低氧刺激PASM

23、Cs時，LOX-1可能也通過激活MAPK通路中ERK1/2通路進一步導致pElk表達增加，pElk與SRF結合增多而導致c-fos表達增加;同時pElk可能也通過抑制MRTF-A信號通路從而使PASMCs從分化型向增殖型轉化。我們假設，低氧PAH時LOX-1可能通過LOX-1-ERK1/2-pElk/MRTF-A-SRF-c-fos通路促進PASMCs增殖。
　　方法: (1)在體實驗:180～220 g SD大鼠，采用低氧倉(1

24、0％ O2)飼養(yǎng)3周誘導低氧PAH大鼠模型。右頸外靜脈插管測定右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)。分離右心室(RV)、左心室加室間隔(LV+IS)并稱重，計算RV/(LV+IS)比值，以確定造模成功。提取肺動脈總RNA或蛋白，real-time PCR或Western Blot檢測pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白的表達;4％多聚甲醛固定肺組織，石蠟包埋，MRTF-A免

25、疫組化染色。(2)細胞實驗:大鼠原代PASMCs采用組織塊貼壁法制備，取第3代細胞進行α-actin免疫組化鑒定細胞。3-6代用于后續(xù)實驗。低氧(3％O2)刺激細胞增殖。(3) LOX-1中和抗體實驗:采用不同濃度LOX-1中和抗體（5、10、20 ng/ml）預孵育細胞1h后低氧處理，real-time PCR或Western Blot檢測pERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMAmRNA或蛋白表達。(4)

26、 LOX-1小分子RNA干擾(siRNA)實驗:當PASMCs達到60％～70％融合后，采用TurboFect轉染試劑分別將LOX-1 siRNA干擾片段瞬時轉入細胞，干擾LOX-1表達，real-timePCR或Western Blot檢測LOX-1 mRNA或蛋白的表達評價不同片段轉染效率，選擇最佳片段的合適濃度進行后續(xù)實驗。LOX-1 siRNA干擾24 h后低氧處理細胞，real-time PCR或Western Blot檢測p

27、ERK1/2、pElk、MRTF-A、SRF、c-fos、α-SMA mRNA或蛋白表達。
　　結果: 1.低氧誘導PAH大鼠肺動脈及低氧誘導PASMCs中pERK1/2、pElk顯著激活，SRF、c-fos表達顯著增加而MRTF-A表達顯著降低;同時，α-SMA在低氧誘導PAH大鼠肺動脈中表達無明顯變化，但低氧誘導PASMCs可顯著下調其表達;2.抑制LOX-1可顯著抑制低氧引起的pERK1/2、pElk激活以及SRF、c-fo