芳香化酶在乳腺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用機制研究.pdf

1、背景與目的：
　　雌激素（estrogen，E2）是乳腺癌的主要致癌原，通過與雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合而促進腫瘤細胞的增殖和生長。在絕經(jīng)后的乳腺癌患者中，雌激素的主要來源是外周組織中的雄激素通過芳香化酶（aromatase，Arom）的催化作用轉化為雌激素，芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors, AIs）可阻斷這一反應，從而阻斷腫瘤細胞的生長,是絕經(jīng)后激素受體陽性的乳腺癌患者輔

2、助內(nèi)分泌治療的一線方案。
　　然而，AIs的耐藥成為臨床應用中的最大問題，過去的研究主要集中在ER，ER信號通路與生長因子受體信號通路之間的串話機制研究，目前AIs的耐藥機制仍不明確。芳香化酶（aromatase, Arom）是利用睪酮合成雌激素的限速酶，廣泛存在于人體，在女性胎盤，脂肪組織及腦（包括下丘腦，海馬，杏仁核等）中含量較高。雄激素經(jīng)芳香化酶、NADPH等輔基的氧化還原反應轉化為雌激素的同時還可產(chǎn)生活性氧（reactiv

3、e oxygen species, ROS）。在正常的生理情況下，機體多種抗氧化酶SOD、GPx、GST、CAT等不斷清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS及自由基。ROS在不斷產(chǎn)生及清除中保持氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)定，并在人體整個生理過程中發(fā)揮重要作用。ROS在腫瘤中也有重要作用，是參與細胞內(nèi)信號傳導的第二信使。已有研究表明ROS、E2可以激活c-src激酶及下游信號通路，Arom可以被c-src激酶磷酸化，磷酸化位點是第361位的酪氨酸（pY361Arom

4、）。我們的前期研究表明Y361-Arom可以與PI3K調節(jié)亞基p-85結合，激活PI3K信號通路，而c-src激酶的抑制劑AZD0530（PP2）可以阻斷這種結合，逆轉乳腺癌細胞對AIs的耐藥。因此我們推測：1、Arom在乳腺癌中維持體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用，對乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展具有重要影響。2、c-src可被ROS、AD激活，繼而引起芳香化酶的磷酸化，激活下游PI3K信號通路，可能是導致AIs發(fā)生耐藥的主要原因之一，pY36

5、1Arom可能是預測乳腺癌對AIs敏感性的一個標志物。本研究制備了特異識別Y361磷酸化芳香化酶的抗體，將對Arom及pY361Arom在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及AIs耐藥的機制進行探索性研究。
　　方法：
　　第一部分 pY361Arom抗體制備及在乳腺癌中的臨床意義
　　1.公司合成多肽片段，通過動物免疫的方法制備了pY361Arom多克隆抗體，用ELISA、免疫印跡、免疫組化等方法鑒定其敏感性和特異性；
　

6、　2.收集汕頭大學醫(yī)學院附屬腫瘤醫(yī)院用AIs內(nèi)分泌治療的絕經(jīng)后乳腺癌患者60名，通過回顧性分析其臨床資料，歸納總結臨床病理資料，采用免疫組化的方法檢測乳腺癌組織中pY361Arom的表達情況，并用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用卡方檢驗及Fisher精確檢驗來分析 pY361表達水平與乳腺癌患者臨床病理學參數(shù)的關系；采用 Kaplan-Meier生存分析方法進行總生存分析，組間比較采用log-rank檢驗法。P≤0.05為差異具

7、有統(tǒng)計學意義。
　　第二部分 Arom在ER陰性的乳腺癌細胞株中的作用
　　1.建立穩(wěn)定敲減Arom的SKBR3-shArom細胞系，采用細胞增殖實驗，劃痕實驗，克隆形成實驗，遷移及侵襲實驗，用免疫印跡法檢測Arom對pAKT(S473), p-85等蛋白的影響來探討Arom對ER陰性的乳腺癌細胞的作用；
　　2.c-Src抑制劑（PP2）處理BT549, SKBR3, MDA-MB-231細胞后，用免疫印跡的方法探討

8、PP2對pAKT(S473), pSrc(Y416), pY361Arom, p-85等蛋白的影響。
　　第三部分 Arom在ER陽性的乳腺癌細胞株中的作用
　　1.采用高表達 ER的BT549-ER細胞株，在無外源性雌激素培養(yǎng)的狀態(tài)下用分別用雌二醇（Estradoil, E2）和雄烯二酮（androstendine, AD）, Letrozole, PP2處理細胞，觀察細胞增殖情況，用免疫印跡法探討其對Src(Y416),

9、 pAKT(S473), p-85, pY361Aro蛋白的影響；
　　2.雄烯二酮（androstendine, AD）, Letrozole, PP2處理細胞，用免疫印跡探討其對pSrc(Y416), pAKT(S473), p-85, pY361Arom等蛋白的影響；
　　3.BT549-ER, SKBR3細胞株，在無外源性雌激素培養(yǎng)的狀態(tài)下，用DCFH-DA法檢測細胞活性自由氧（reactive oxgene spe

10、cies, ROS）水平的方法探討AD，Letrozole對細胞內(nèi)ROS的影響。
　　結果：
　　第一部分
　　1.制備了pY361Arom多克隆抗體，效價約1:1萬，該抗體可用于ELISA, WB, IHC, IF。WB可特異性的檢測到蛋白pY361Arom，大小約55KD，最佳濃度1:1000，IHC最佳濃度1:2500，IF最佳濃度1:400,均為4℃過夜；
　　2.pY361Arom主要定位在乳腺癌細胞漿

11、內(nèi)，Kaplan-Meier生存分析顯示pY361Arom高表達與患者總生存期顯著相關，p≤0.05。但pY361Arom的表達與患者年齡、組織學分級、分期、ER、PR、Her2表達無相關性。
　　第二部分
　　1.敲減Arom后SKBR3細胞增殖減弱，與對照組相比p=0.042，具有統(tǒng)計學差異，遷移能力從95％±4.5%下降到36%±4.6%，侵襲能力從94%±4.3%下降到42%±4.2%和克隆形成能力從60%±4.5%

12、下降到38%±4.3%，經(jīng)統(tǒng)計檢驗，p≤0.05具有統(tǒng)計學差異，敲減Arom后, pAKT（S473）蛋白表達降低，p-85蛋白表達不變；
　　2.PP2處理BT549，MDA-MB-231, SKBR3細胞后pSrc(Y416)，pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表達降低；
　　3.SKBR3細胞免疫熒光Arom與p-85，pY361Arom與p-85在細胞漿共定位。
　　第三部分
　　1.AD，E2

13、促進BT549-ER細胞增殖能力，AD最佳濃度為100nM，與對照組相比p=0.04，E2最佳濃度為1nM,與對照組相比p=0.03，PP2，Letrozole處理BT549-ER細胞后,細胞增殖能力降低，與對照組相比p≤0.05具有統(tǒng)計學差異；
　　2. AD濃度100nM處理BT549-ER后細胞后，pSrc(Y416)，pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表達明顯升高。PP210μM，Letrozole100nM處理

14、BT549-ER細胞后免疫印跡pSrc（Y416），pY361Arom，pAKT（S473）蛋白表達降低；
　　3.DCFH-DA法檢測BT549細胞過表達ER前后加用100nM濃度AD處理2小時后，細胞內(nèi)ROS水平明顯上升分別上升約45%±4.2%和47%±3.6%，p≤0.05具有統(tǒng)計學意義，Let處理2小時后兩株細胞內(nèi)ROS水平均無明顯變化。SKBR3經(jīng)AD處理后ROS水平升高約48%±3.2%，與未作任何處理的對照組相比具

15、有統(tǒng)計學意義，p≤0.05，而經(jīng)Let處理后ROS水平無明顯變化；在敲減了Arom的細胞SKBR3-shArom中，經(jīng)AD和Let處理后細胞內(nèi)ROS水平無明顯變化。
　　結論：
　　1.制備了pY361Arom兔多克隆抗體。
　　2.Arom敲減后可抑制SKBR3細胞的增殖、遷移、侵襲、克隆形成，可能機制是下調pAKT（S473），同時對細胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)定有重要調控作用，影響著乳腺細胞的發(fā)生和發(fā)展。
　　3.Sr

16、c抑制劑PP2對BT549，MDA-MB-231細胞敏感，而對SKBR3細胞不敏感。
　　4.AD, E2可刺激BT549-ER細胞的增殖，PP2，Letrozole可抑制其細胞的增殖。
　　5.pY361Arom可能是一個預測AIs耐藥的分子標志，其機制可能是AD通過芳香化酶及NADPH的氧化還原反應生成E2同時產(chǎn)生ROS，ROS及AD本身激活Src，引起pY361Arom活化，激活PI3K/AKT/mTOR，引起腫瘤細胞