磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機制中的作用研究.pdf

1、第一部分P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA在中耳膽脂瘤上皮中的表達及其意義
　　 目的:探討P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達及其意義。
　　 方法:采用免疫組織化學方法檢測40例后天性中耳膽脂瘤組織和20例正常外耳道皮膚組織中P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白的表達水平，并分析它們之間的相關性。
　　 結果:40例中耳膽脂

2、瘤上皮組織標本中P-EGFR蛋白陽性率為65.0％(26/40);P-Akt蛋白陽性率為72.5％(29/40);cyclinD1蛋白陽性率為62.5％(25/40);PCNA蛋白陽性率為80.0％(32/40)。對照組20例正常外耳道皮膚組織中P-EGFR蛋白陽性率為20.0％(4/20);P-Akt蛋白陽性率為35.0％(7/20);cyclinD1蛋白陽性率為10.0％(2/20);PCNA蛋白陽性率為45.0％(9/20)。經統(tǒng)

3、計學分析:P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA四種蛋白在中耳膽脂瘤組和正常外耳道皮膚組中的表達差異均有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05);中耳膽脂瘤組中P-EGFR與P-Akt的表達、P-Akt與cyclinD1的表達、cyclinD1與PCNA的表達均呈顯著正相關(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.P-EGFR、P-Akt、cyclinD1和PCNA蛋白在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達增高，且中耳膽脂

4、瘤組中P-EGFR與P-Akt的表達、P-Akt與cyclinD1的表達、cyclinD1與PCNA的表達均呈顯著正相關，提示中耳膽脂瘤上皮細胞中EGFR活化的同時伴隨著其下游效應因子P-Akt、cyclinD1和PCNA的活化。
　　 2.EGFR/PI3K/Akt信號通路可能在中耳膽脂瘤上皮細胞過度增殖機制中起到重要作用，參與了中耳膽脂瘤的發(fā)病機制。
　　 第二部分人正常外耳道表皮角質化細胞原代培養(yǎng)及鑒定
　　

5、 目的:建立人正常外耳道表皮角質化細胞(humanextemalearcanalkeratinocytes)原代培養(yǎng)體系，觀察細胞形態(tài)學特征與生物學特性，并對原代培養(yǎng)的細胞進行鑒定，為后續(xù)實驗研究打下基礎。
　　 方法:取中耳手術耳甲腔成形時切取的外耳道口皮膚作組織塊培養(yǎng)，經選擇性消化分離出表皮層作表皮角質化細胞培養(yǎng)。觀察細胞形態(tài)及生長特征，行細胞計數(shù)并描繪細胞生長曲線圖，采用免疫熒光染色方法對原代培養(yǎng)的細胞進行鑒定。

6、　　 結果:原代細胞培養(yǎng)約5d后可以觀察到由數(shù)個細胞組成的細胞集落，細胞集落逐漸向外生長。約15d之后，所獲得的細胞融合形成片狀單細胞層?？梢娂毎尸F(xiàn)出多角形，相互連接呈鋪路石狀。免疫熒光染色可見細胞角蛋白染色呈陽性，符合人表皮角質化細胞的形態(tài)學特征與生物學特征。原代培養(yǎng)的正常外耳道表皮角質化細胞接種后2d內細胞增殖比較緩慢，第3d起細胞增殖速度加快，約第7～8d時達到峰值，其后細胞數(shù)量緩慢下降。
　　 結論:本實驗所建立的細

7、胞系為人正常外耳道表皮角質化細胞，該細胞系的建立為后續(xù)進一步探討中耳膽脂瘤的發(fā)病機制提供了良好的研究材料。
　　 第三部分EGF對外耳道表皮角質化細胞增殖和遷移的影響及其作用機制
　　 目的:探討EGF對原代培養(yǎng)的外耳道表皮角質化細胞增殖、細胞周期及遷移能力的影響，并檢測EGF干預后EGFR、P-EGFR、Akt、P-Akt、cyclinD1等相關蛋白的表達變化情況。
　　 方法:分別用EGF、AG1478(EG

8、FR抑制劑)與Wortmannin(PI3K抑制劑)干預原代培養(yǎng)的外耳道表皮角質化細胞，MTT實驗檢測其對細胞生長的影響;流式細胞術檢測其對外耳道表皮角質化細胞周期的影響;transwell細胞遷移實驗檢測其對外耳道表皮角質化細胞遷移能力的影響;Westernblotting方法檢測外耳道表皮角質化細胞EGFR、P-EGFR、Akt、P-Akt、cyclinD1等相關蛋白表達的改變情況。
　　 結果:
　　 1.MTT實

9、驗:EGF可以顯著地促進原代培養(yǎng)的外耳道表皮角質化細胞的增殖，EGF對外耳道表皮角質化細胞生長的促進作用隨著其作用濃度的提高與作用時間的延長而增強;用AG1478和Wortmannin預處理細胞后，發(fā)現(xiàn)AG1478和Wortmannin可以明顯地抑制EGF對外耳道表皮角質化細胞的促增殖作用。
　　 2.流式細胞術:EGF刺激外耳道表皮角質化細胞后可使細胞S期比例增加，G1期比例減少;而用AG1478和Wortmannin預處理細

10、胞后再用EGF刺激細胞，發(fā)現(xiàn)細胞G1期比例增加，S期比例減少。
　　 3.Westernblotting:EGF刺激外耳道表皮角質化細胞后，P-EGFR表達快速上調，干預40min時P-EGFR表達量達最高值;P-Akt表達也快速上調，干預20min時P-Akt表達量達最高值;cyclinD1表達在干預24h后明顯升高。用AG1478和Wortmannin預處理細胞后再用EGF刺激細胞，Westernblotting結果發(fā)現(xiàn)P-

11、EGFR、P-Akt和cyclinD1表達減少。整個實驗過程中EGFR和Akt的總量并無變化。
　　 4.transwell細胞遷移實驗:EGF干預組遷移到下室的外耳道表皮角質化細胞平均數(shù)目明顯高于對照組(P＜0.05);AG1478+EGF干預組與Wortmannin+EGF干預組遷移到下室的外耳道表皮角質化細胞平均數(shù)目明顯少于EGF干預組(P＜0.05)。
　　 結論:
　　 1.EGF可激活EGFR/PI3

12、K/Akt信號通路，從而促進外耳道表皮角質化細胞增殖;而EGFR/PI3K/Akt信號通路抑制劑AG1478和Wortmannin則可以抑制該作用。
　　 2.EGF可激活EGFR/PI3K/Akt信號通路，從而增強外耳道表皮角質化細胞的遷移能力，而EGFR/PI3K/Akt信號通路抑制劑AG1478和Wortmannin則可以抑制該作用。
　　 3.EGFR/PI3K/Akt信號通路可能參與了中耳膽脂瘤發(fā)病機制，靶向阻