青蒿萜類合成酶基因及啟動子的克隆與功能分析.pdf

1、萜類化合物以異戊二烯（C5）為結構單元構成了植物界中最大的天然化合物家族，是植物次生代謝物中重要的組成部分。植物通過次生代謝合成多種萜類化合物以防御各類生物和非生物脅迫。萜類還具有重要經濟價值，可用作香精香料、藥物以及殺蟲劑等等。萜類合成酶通常是催化萜類化合物合成途徑的第一個關鍵酶，其基因表達受到轉錄因子、激素、逆境等多種因素的調控，進而構成了復雜的次生代謝網絡。
　　青蒿（Artemisia annua L.）是一年生草本植物，

2、其次生代謝產物中的青蒿素是重要的抗瘧疾藥物。同時，青蒿精油中還富含功能各異的單萜和倍半萜，例如1,8-桉葉醇，石竹烯，青蒿酮等等。青蒿素合成途徑中的ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1等關鍵結構酶基因已被發(fā)現，然而還存在較多其他的萜類合成酶基因有待克隆和鑒定，以加深對萜類化合物功能和結構的了解。
　　本研究從青蒿腺毛轉錄組文庫中克隆得到兩條萜類合成酶基因AaTPS7和AaTPS8。生物信息學分析結果顯示AaTPS7全長1

3、863 bp，編碼含620個氨基酸的蛋白，與青蒿中幾種單萜合酶有較高的同源性。AaTPS8全長1683 bp，編碼含560個氨基酸的蛋白，與菊科不同植物的大根香葉烯A合酶同源性較高。體外酶催化實驗表明AaTPS8是一種倍半萜合酶，能催化FPP生成三種產物，主產物為臭根醇。雖然GC-MS沒有檢測到AaTPS7催化FPP或GPP生成的產物，但經過多重序列比對和進化分析后，推測其為單萜合酶。實時熒光定量PCR結果顯示AaTPS7和 AaTPS

4、8在青蒿不同組織和不同部位葉片中不同程度表達，在幼嫩的葉片，莖或花蕾中的表達量相對較高。
　　運用基因組步移法克隆了AaTPS7和AaTPS8的啟動子區(qū)域，長度分別為1167 bp和1629 bp。生物信息學分析發(fā)現了啟動子中存在多個順式調控元件，例如WRKY類轉錄因子結合位點W-box和MYB類轉錄因子結合位點MBS，以及響應MeJA的CGTCA-motif和響應ABA的ABRE元件，推測兩個啟動子可能受到轉錄因子、機械損傷等多

5、種因素的調控。構建啟動子與 GUS基因的融合載體并轉化青蒿，GUS染色結果表明這兩個啟動子驅動基因在非分泌型腺毛中的特異表達，而在分泌型腺毛中完全沒有染色。由于青蒿素的合成和儲存都發(fā)生在分泌型腺毛，因而推測AaTPS7和AaTPS8與青蒿素的合成關聯較小。對轉基因青蒿噴灑MeJA和ABA，3小時后GUS基因表達水平有所上調，說明proTPS7和proTPS8能受到兩種激素的誘導。組成型啟動子普遍應用于基因工程研究，但仍存在許多不足。腺毛