小麥Mlo基因RNAi表達載體的構(gòu)建和反義表達植株后代的分子檢測.pdf

1、小麥白粉病是由專性寄生真菌一小麥白粉菌(ErysiPe graminisf.sp．Tritici) 引起的一種全球性危害小麥的嚴重病害，對小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)有著極大的影響。施用農(nóng)藥雖然能在一定程度上減輕病害，但卻嚴重危害生態(tài)環(huán)境和產(chǎn)品。白粉菌生理小種眾多，變異速度很快，常規(guī)育種獲得的小麥抗性品種往往因為白粉菌生 理小種的變異而失去抗性，這就大大縮短了品種的使用年限，因此利用基因工程 方法選育廣譜抗白粉病品種可能是最為經(jīng)濟和有效的方法

2、。研究表明大麥訛基因的隱性突變mlo可以使大麥對幾乎所有已知大麥白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.hrdei)生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗病性。小麥是大麥的近緣種，而目二者的Mlo基因的cDNA有92％的同源性，因而它們有著相似的作用機制。本實驗室已獲得小麥Mlo基因cDNA片段(長1434bp)，所以可以通過RNAi技術(shù)或 者反義技術(shù)關(guān)閉或者減弱植物本身Mlo基因的表達，賦予植物抗病性。RNAi是一種抑制基因表

3、達的技術(shù)手段，所具有的特異性、穩(wěn)定性、高效、快速等特性為研究未知功能的基因提供了新的反向遺傳學手段，在應用研究中也發(fā)揮著越來越重要的作用。本研究分別在小麥Mlo基因cDNA片段(1434bp)編碼區(qū)的5’和3’(對應于小麥ML0蛋白的N端和C端)選擇抑制效率較高的部分，構(gòu)建了植物RNAi表達載體pRI-Nmlo和pRI-Cmlo，并轉(zhuǎn)化了小麥優(yōu)質(zhì)品種煙優(yōu)361。 我們還對小麥Mlo基因eDNA片段的反義表達載體pRAL-anti

4、-mlo轉(zhuǎn)基因T<,0>、T<,1>,T<,2>代植株進行了分子檢測。從生物安全性的角度考慮，我們所使用的植物表達載體不含選擇標記基因，所以不能通過抗生素或者除草劑進行篩選，而只能運用分子檢測和表型鑒定來選擇轉(zhuǎn)基因陽性植株。由于我們使用小麥Mlo基因cDNA片段，理論上應該可以與植株內(nèi)源的含內(nèi)含子的基因組序列相互區(qū)分，但是小麥是異源六倍體，基因組情況比較復雜，推測可能含有多個Mlo同源基因，構(gòu)成一個基因家族，這種基因組背景的復雜性為轉(zhuǎn)基

5、因的檢測帶來不少的困難，經(jīng)過摸索，采用巢式PCR的方法進行柃測。 根據(jù)PCR檢測的結(jié)果，在To代植株中，以核生3號為受體的轉(zhuǎn)化率為6.7％，煙2801為6.3％，平均為6.6％。由于農(nóng)桿菌介導的苗端轉(zhuǎn)化法不能保證所有莖尖分生組織均被轉(zhuǎn)化，To代有可能是嵌合體，因此To代的檢測并不十分可靠，需要對其后代進行鑒定才能確定目的基因是否轉(zhuǎn)入。T<,1>代植株中，根據(jù)株系所計算的轉(zhuǎn)化率分別為：核生3號的轉(zhuǎn)化率為19.2％，煙2801為15