杏鮑菇中SOD的分離純化、脂質(zhì)體制備及其抑制腫瘤細(xì)胞活性研究.pdf

1、在細(xì)胞的氧化代謝過(guò)程中，不斷產(chǎn)生各種活性氧。在細(xì)胞處于正常狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)起著清除自由基的作用，使細(xì)胞處于一個(gè)氧化平衡狀態(tài)。但當(dāng)機(jī)體處于衰老、氧化應(yīng)激或某些病理情況下時(shí)，活性氧產(chǎn)生增多或機(jī)體清除能力減弱，過(guò)量的活性氧對(duì)組織細(xì)胞的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞性修飾，損傷正常組織細(xì)胞的形態(tài)和功能。SOD是生物體防御活性氧毒害的關(guān)鍵性防線。研究表明，SOD與癌癥等多種疾病之間有著極其密切的關(guān)系。本課題以杏鮑菇為原材料，通過(guò)超聲波破碎、硫酸銨分級(jí)

2、沉淀、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析等方法分離純化了SOD，并通過(guò)UV、MALDI-TOF-TOFMS、ICP-MS、SDS-PAGE、HPLC等分析方法對(duì)該SOD的類型及純度進(jìn)行了鑒定。此外，通過(guò)單因素考察和正交實(shí)驗(yàn)的方法優(yōu)化了SOD脂質(zhì)體的制備工藝，并研究了所制得SOD脂質(zhì)體的生物學(xué)功能。
　　 本課題以杏鮑菇子實(shí)體為原料，分離純化得到了液相純的SOD，活性為3900U/mg，純化倍數(shù)為177倍，回收率為13.0％。在提取過(guò)程中

3、對(duì)超聲破碎功率、破碎時(shí)間、層析順序等因素進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇的超聲功率是160W，超聲時(shí)間為9min。MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀測(cè)定結(jié)果顯示，該SOD分子量為31503，亞基分子量為15790;ICP-MS顯示該SOD含銅和鋅而不含錳；紫外光譜顯示該SOD在258nm處具有最大吸收；活性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該SOD對(duì)雙氧水和疊氮鈉敏感，而對(duì)SDS不敏感；這些證據(jù)均證明該SOD為Cu/Zn-SOD。
　　 本文以脂質(zhì)體的包封率及

4、粒徑為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素考察磷脂與膽固醇比例、超聲時(shí)間、水相pH值及水相體積對(duì)制備脂質(zhì)體包封率影響的基礎(chǔ)上，利用正交設(shè)計(jì)方法對(duì)SOD脂質(zhì)體的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化。最終確定SOD脂質(zhì)體的制備條件為PC∶CH=1∶1,pH值為8.2，超聲時(shí)間為8min，水相體積為3mL。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的SOD脂質(zhì)體在2個(gè)月內(nèi)滲漏率小于20％。
　　 本文以制備得到的SOD脂質(zhì)體作為藥物，并以未包封SOD作為對(duì)照，研究了SOD脂質(zhì)體抑制肝癌

5、細(xì)胞生長(zhǎng)的能力。結(jié)果顯示，SOD脂質(zhì)體能很好地抑制肝癌細(xì)胞hepG2和肝正常細(xì)胞L02生長(zhǎng)，而未包封SOD則未顯示出任何抑制作用。將白藜蘆醇制成脂質(zhì)體后，則發(fā)現(xiàn)包封前與包封后白藜蘆醇抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用的變化不大。對(duì)SOD脂質(zhì)體作用后細(xì)胞內(nèi)SOD活性及ROS含量的測(cè)定結(jié)果表明，加入SOD脂質(zhì)體后，細(xì)胞內(nèi)SOD活性增加，ROS含量減少。說(shuō)明SOD抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)理可能是SOD進(jìn)入細(xì)胞并清除了細(xì)胞內(nèi)的ROS，導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡，而未包封SOD