雞白介素-5酵母表達(dá)及其單克隆抗體的研制.pdf

1、白細(xì)胞介素-5（interleukin-5，IL-5)位于 Th2細(xì)胞因子群中，其在激發(fā)機(jī)體粘膜免疫、體液免疫等多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制方面都有十分重要的作用。然而目前雞IL-5的研究?jī)H僅停留在對(duì)其基因的克隆與原核表達(dá)，有研究報(bào)道稱雞 IL-5基因缺乏相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)機(jī)制，可能是個(gè)假基因。隨著雞 IL-5基因首次從雞體內(nèi)被成功克隆，那么現(xiàn)階段該基因能否在體內(nèi)進(jìn)行翻譯表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物是否具有活性功能，這些都是非常值得探討的問(wèn)題。因此本研究通過(guò)對(duì)雞 I

2、L-5基因在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，利用酵母表達(dá)產(chǎn)物制備雞 IL-5單克隆抗體，并對(duì)單克隆抗體的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。從而為進(jìn)一步研究該基因的翻譯表達(dá)及雞 IL-5的免疫學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。其主要的研究?jī)?nèi)容如下：
　　1、雞白介素-5酵母表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
　　應(yīng)用雞IL-5特異性引物以pMD18T-IL-5為模板擴(kuò)增出雞IL-5基因片段，將目的片段回收純化后連接至畢赤酵母表達(dá)載體 pPICZαA，獲得重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA

3、-IL-5。進(jìn)而利用PmeⅠ線性化重組載體pPICZαA-IL-5并將其電轉(zhuǎn)化入酵母菌X-33中，在1.5％甲醇濃度誘導(dǎo)下進(jìn)行酵母表達(dá)，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。結(jié)果顯示雞 IL-5基因獲得成功的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)物上清中表達(dá)出具有反應(yīng)活性的26KD左右的重組雞 IL-5蛋白。其最佳表達(dá)條件為PH6.0、1.5%甲醇濃度、誘導(dǎo)96h。
　　2、抗雞白介素-5蛋白抗體間接ELISA方法的建立
　　以純化的雞 I

4、L-5蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)雞 IL-5蛋白抗體的間接ELISA方法。試驗(yàn)結(jié)果確定了間接ELISA的最佳反應(yīng)條件：抗原包被濃度10.00μg/mL，包被時(shí)間為37℃2h，血清稀釋度1:1600，HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體稀釋度為1:1000，血清與抗原在37℃反應(yīng)60min，血清和二抗于37℃反應(yīng)60min；應(yīng)用該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示建立的ELISA方法具有較好的特異性和重復(fù)性，適用于檢測(cè)雞IL-5蛋白抗體。

5、>　　3、抗雞白介素-5單克隆抗體的制備與性質(zhì)分析
　　將純化的雞 IL-5蛋白與等量的弗氏（不）完全佐劑充分乳化后，采用頸部皮下注射方式，免疫6-8周齡的純系 Balb/C雌鼠，經(jīng)過(guò)四次免疫后檢測(cè)血清效價(jià)達(dá)到1:104進(jìn)行沖擊免疫，三天后取小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0在50%PEG4000作用下進(jìn)行融合，經(jīng)過(guò)HAT篩選培養(yǎng)基以及間接ELISA檢測(cè)方法篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)3次亞克隆最終篩選到2株單克隆抗