MACC1基因對胃癌細胞株BGC-823基因表達的影響.pdf

1、研究背景:
　　 胃癌是消化系統常見腫瘤，在世界范圍，胃癌死亡率居世界第二位，雖然在發(fā)達國家，近年胃癌發(fā)病率有所下降，但在我國，根據最新的統計資料，我國城市胃癌的死亡率居惡性腫瘤死亡率的第三位，在農村，胃癌的死亡率甚至居于第一位。外科手術仍是其主要的治療方法，但僅有30-50％的患者可獲得根治性切除，雖然目前針對胃癌的藥物及治療方法較多，但療效并不滿意，究其原因，胃癌的早期轉移是死亡率高的重要原因，故而研究胃癌早期轉移的機制及其

2、標志物就顯得尤為重要了。
　　 2009年stein等人報道了MACC1(Metastasis-associated in colon cancer1)基因在腸癌中的可能作用，他們研究發(fā)現MACC1的表達水平與生存率明顯相關，低表達的患者5年生存率為80％，而高表達者其5年生存率僅有15％。發(fā)生轉移的患者的MACC1mRNA水平明顯高于未轉移患者(p＜0.0001)，Logistic和Cox回歸分析表明，MACC1可以作為腸癌轉

3、移的預后指標。繼而出現大量的研究報道MACC1不僅在腸癌,而且與肝細胞癌、肺癌、胃癌等實體腫瘤的轉移相關。其中，有學者發(fā)現在MACC1基因在發(fā)生血管轉移的肝細胞癌中高表達，Shimokawa H等人收集了146例Ⅰ期肺腺癌術后標本，發(fā)現MACC1的表達水平與預后密切相關。而在胃癌中，目前有文獻報道MACC1基因的表達與其腹膜轉移相關。這些均表明MACC1在早期發(fā)現腫瘤轉移及復發(fā)方面具有重要的指導作用，極有可能作為一個腫瘤預后的分子標志物

4、。但是在胃癌方面的作用仍不深入，需進一步的探討研究。
　　 研究MACC1基因功能，需要大量的體內體外實驗，所以構建合適的MACC1表達載體是研究其結構功能的必要基礎。目前國內尚未見構建胃癌MACC1表達載體的相關報道。本研究應用293FT細胞為模板，成功擴增出MACC1全長cDNA序列及MACC1表達的干擾片段，構建過表達載體及干擾表達載體，為研究該基因在多種類型腫瘤中的作用及機制奠定了基礎。已有文獻報道，胃癌中MACC1基因

5、與其腹膜轉移相關，為了進一步研究其作用機制，我們首次成功建立了穩(wěn)定表達MACC1的胃癌pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株及其MACC1基因沉默表達的細胞株sh-MACC1/BGC-823，并對MACC1的表達情況通過RT-PCR及Western blot進行驗證分析，為探討MACC1在胃癌中的作用機制提供了可靠保證。
　　 基因芯片又稱DNA微陣列（DNA microarray），該技術是指將大量探針分子固定于支持物上

6、，將樣品分子標記，然后將兩者進行雜交，利用相關軟件收集雜交信號，從而獲取樣品分子的數量和基因信息。通過不同的探針序列的設計、不同的分析方法使得該技術的應用價值也各有不同，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。
　　 隨著20世紀80年代人類基因組計劃的開展，結構基因組學已經得到了充分的認識，而功能基因組學方面仍存在太多的未知領域，基因芯片技術的出現給功能基因組的研究提供了一個全新的平臺?；虮磉_譜芯

7、片目前應用比較廣泛，技術比較成熟，它可以檢測整個基因組的各個基因mRNA的變化水平。傳統的研究方法僅僅局限于某個或某幾個基因和他們之間簡單的調控關系，無法全面的認識和研究腫瘤整個發(fā)生過程中基因復雜的調控關系。而基因芯片恰恰能解決傳統研究方法的不足之處，其以大規(guī)模高通量的方法研究成千上萬的基因在不同狀態(tài)下的表達，預測他們的功能，預測他們之間的復雜的相互調控關系。從基因水平研究腫瘤相關基因的變化，通過基因芯片技術篩選和檢測腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉

8、移過程中的差異表達基因，不但可以從病理狀態(tài)中尋找可能病因，也為早期的診斷及預后提供依據，基因芯片技術和臨床的相互結合將為成為未來研究發(fā)展的一個必然趨勢。胃癌的發(fā)生發(fā)展轉移是多種因素的相互之間的作用、多個基因表達異常的結果，其具體分子機制至今仍未能闡明。這就需要基因芯片技術幫助我們對其進一步的研究。
　　 本研究中我們通過基因轉載技術，構建了MACC1過表達（pBaBb-MACC1/BGC-823）及沉默（sh-MACC1/BGC

9、-823）紐胞株，然后利用基因芯片技術對這兩個細胞株進行檢測分析，發(fā)現MACC1的改變引起細胞株基因的廣泛改變，其中LHX9、PDK3及PLEKHA5與MACC1的表達趨勢完全一致，IL8、MYO1A及OST-β則與MACC1的表達趨勢完全相反，進而通過文獻查閱，希望找到與MACC1相互調控的關系或與胃癌早期轉移的相關性，為下一步的功能研究奠定了基礎。
　　 目的:
　　 1.通過基因轉載技術建立穩(wěn)定過表達MACC1基因

10、的胃癌細胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及穩(wěn)定抑制其表達的細胞株sh-MACC1/BGC-823;
　　 2.利用基因芯片研究 MACC1表達改變的細胞株pBaBb-MACC1/BGC-823, sh-MACC1/BGC-823及正常細胞株BGC-823之間的基因表達譜差異;
　　 3.尋找與MACC1表達趨勢一致及相反的差異表達基因，探討MACC1與差異表達基因之間可能存在的細胞信號通路或各方面調節(jié)機制的聯系

11、。
　　 方法:
　　 1.以人胚腎293FT細胞為模板，經PCR擴增獲全長MACC1 cDNA序列，將目的基因序列及干擾目的基因的片段序列克隆入pBaBb-puro及pSUPERretro-puro表達載體，建立pBaBb-puro-MACC1過表達載體和pSUPERretro-puro-MACC1抑制MACC1基因表達的載體。經過酶切鑒定、測序并觀察轉染293FT細胞報告基因表達情況從而判斷是否構建成功。將構建好的兩

12、個載體分別轉染入人胃痛BGC-823細胞，感染結束后48h加入puromycin（0.5μg/ml）篩選陽性克隆，然后在培養(yǎng)瓶中擴增培養(yǎng)并傳代建系。收集細胞的RNA，進行熒光定量PCR及Western blot檢測MACC1在這些細胞中表達情況，并采用SPSS13.0統計軟件進行處理，通過單因素方差分析(one-way ANOVA)比較各組之間差異以鑒定穩(wěn)定細胞株。
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13、imbleGen表達譜芯片對MACC1基因轉染前后的胃癌細胞株BGC-823的基因進行研究，該芯片包括45033個基因。分別提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，用NimbleGen進行標記，進而用NimbleGen雜交系統進行雜交和NimbleGen緩沖液試劑盒洗滌，芯片結果采用Axon Genepox4000B掃描儀進行掃描，通過NimbleScan軟件讀取數據，進行標準化等分析后輸入Agilent GeneSpringGX軟件進一步

14、分析。差異基因的篩選標準為ratio≥2，為避免實驗誤差，每個細胞株各重復3次。
　　 3.通過分析找出在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調、sh-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調及在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調、sh-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調的基因，利用qRT-PCR進行驗證，并采用SPSS13.0統計軟件進行處理，通過單因素方差分析(one-wayAN

15、OVA)比較各組之間差異篩選出相關基因。通過文獻的查閱，試圖尋找與MACC1的相關性，為胃癌的早期轉移研究提供依據。
　　 結果:
　　 1.成功擴增全長的MACC1cDNA及干擾片段，經測序鑒定完全正確;轉染293FT細胞可見清晰的綠色熒光表達，順利構建了MACC1過表達及沉默的穩(wěn)定細胞株，通過qRT-PCR及Western blot檢測發(fā)現pBaBb-MACC1/BGC-823、sh-MACC1/BGC-823穩(wěn)定細

16、胞株構建成功。
　　 2.對過表達、沉默及正常的胃癌細胞株BGC-823進行基因表達譜分析后發(fā)現表達上調及下調基因多達數千種，這些差異表達基因的功能涉及多個方面，包括與細胞凋亡及周期調控、腫瘤發(fā)生進展相關、酶活性基因調控、信號轉導轉錄及翻譯活性調控等多個方面，找出在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調、sh-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調及在pBaBb-MACC1/BGC-823細胞株中表達下調、s

17、h-MACC1/BGC-823細胞株中表達上調的基因LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β六個基因，并對其進行qRT-PCR驗證并和統計學分析，與基因芯片結果一致。
　　 3.查閱文獻資料，對LHX9、PDK3、PLEKHA5、IL8、MYO1A及OST-β基因進行結構、功能等方面的研究分析，找出可能與MACC1的相關性或與腫瘤發(fā)生轉移的相關性，為胃癌早期轉移的進一步研究提供方向。
　　 結論

18、:
　　 1.我們成功建立了MACC1基因轉染及抑制其表達的細胞株pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823，通過驗證表明其穩(wěn)定表達，統計學分析具有顯著性差異。
　　 2.應用基因芯片技術對3個細胞株差異基因進行篩選，發(fā)現MACC1基因的改變引起pBaBb-MACC1/BGC-823及sh-MACC1/BGC-823細胞株廣泛的基因改變，找出與MACC1表達趨勢一致及相反的6個基因，并對這些

19、基因進行qRT-PCR驗證，結果提示與基因芯片結果一致。
　　 3.MACC1基因轉染胃癌細胞株BGC-823后引起的胃癌細胞基因表達譜廣泛改變，這些基因的功能涉及腫瘤發(fā)生轉移、細胞周期調控、蛋白轉錄翻譯、信號轉導轉錄等多個方面。
　　 4.對差異基因的分析發(fā)現MACC1基因引起胃癌細胞基因表達譜中一些非常重要的信號轉導通路上分子的改變，其中與MACC1表達趨勢完全一致和相反的基因可能與胃癌的發(fā)展轉移存在相關性，但是與M