軍團菌PAL抗原基因的克隆及原核表達.pdf

1、目的：比較軍團菌痰培養(yǎng)，血清中軍團菌特異性Lp-IgM、Lp-IgG抗體檢測和尿液中Lpl抗原檢測這三種方法的陽性檢出率；通過擴增軍團菌Peptidoglycan-associated lipoprotein(PAL)基因，實現(xiàn)嗜肺軍團菌PAL基因在大腸埃希桿菌中的高效表達，為下一步研發(fā)軍團菌檢測試劑盒做準備。
　　方法：1）取300例下呼吸道感染患者的痰，血清和尿液，分別進行軍團菌痰培養(yǎng)，血清中軍團菌特異性Lp-IgM、Lp-I

2、gG抗體檢測和尿液中的Lpl抗原檢測，對比研究三種檢測方法的陽性檢出率；2）設計引物，采用聚合酶鏈反應(PCR)，從嗜肺軍團菌基因組DNA中擴增嗜肺軍團菌PAL基因，并將其定向克隆至原核表達載體PEI-28a(+)，構建原核表達重組質粒PET-PAL，經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定、PCR及測序分析后，轉化宿主菌大腸桿菌BL21，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導表達，產(chǎn)物進行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)。
　　結果：

3、1）軍團菌痰培養(yǎng)，血清中軍團菌特異性Lp-IgM、Lp-IgG抗體檢測和尿液中的Lpl抗原檢測三者陽性檢出率如下：痰培養(yǎng)0.67％，Lp-IgM和Lp-IgG分別為5.00%和18.33%，Binax NOW ICT層析條檢測無一例陽性。2）擴增出長度為531bp的嗜肺軍團菌PAL基因，構建了重組質粒PET-PAL，并在原核系統(tǒng)中表達出19 kDa的抗原區(qū)帶。
　　結論：1）ELISA檢測抗軍團菌特異性Lp-IgG抗體陽性檢出率為