Il-20在支氣管哮喘Th2免疫應答及氣道重塑中作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　哮喘是一種發(fā)病機制十分復雜的常見疾病，涉及多種細胞及細胞因子的共同參與，目前認為哮喘的病理生理過程主要有氣道高反應性，氣道炎癥，粘液細胞的過度分泌，氣道重塑等，其中氣道重塑是固定性氣流受限、肺功能受損的病理生理基礎。哮喘一直被認為是Th2疾病，這種疾病是由Th2細胞因子水平升高而引起IgE和嗜酸性粒細胞增加的炎癥反應。機體吸入致敏原后刺激機體產生抗原，抗原被抗原提呈細胞樹突狀細胞捕獲，隨后被提呈給輔助T(Th)細胞

2、，激活Th2細胞擴增，隨之Th2細胞因子如白介素4(IL-4)、白介素5(IL-5)、白介素13(IL-13)等產生并釋放從而誘發(fā)氣道炎癥。另外己知Th-17細胞、Th-19細胞及其分泌的多種炎性因子如:白介素17A(IL-17A)、白介素17F(IL-17F)、白介素22(IL-22)和白介素19(IL-19)也參與哮喘的調節(jié)。這些炎癥因子也誘導炎癥形成，促進氣道平滑肌的收縮，誘發(fā)哮喘。氣道重塑是哮喘的另一重要病理生理特征，反復氣道炎

3、癥破壞氣道上皮組織，而破壞了的上皮細胞進行修復，從而形成了損傷修復的循環(huán)。處于修復階段的上皮細胞產生促纖維介質及炎前性細胞因子。促纖維介質包括生長因子-β(TGF-β)、纖維生長因子、內皮素，這些促纖維介質可調節(jié)纖維母細胞、肌成纖維細胞分泌膠原、彈性纖維、蛋白多糖、糖蛋白，從而引起氣道壁增厚。肌成纖維細胞分泌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ膠原蛋白、纖連蛋白(FN)、細胞粘合素也促進氣道壁的增厚。TGF-β1介導肺泡上皮細胞向間充質細胞轉化(epithel

4、ial to mesenchymaltransition，EMT)，通過EMT促進氣道重塑的發(fā)展，在這一過程中嗜酸性粒細胞、肥大細胞也起重要作用。促炎性細胞因子白介素25(IL-25)、白介素33(IL-33)等刺激基質增殖導致也加重了氣道重塑的形成，氣道重塑過程中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原表達增加，其中FN、α-SMA被看做是氣道重塑的標記。
　　根據國內外該領域的研究，目前仍未解決的問題有:(1)IL-20及其受體

5、是否在支氣管哮喘氣道上皮中表達增高，是否與哮喘的嚴重程度相關;(2)IL-20的表達是否與支氣管哮喘的Th2免疫應答有關;(3)IL-20在支氣管哮喘氣道重塑中是否發(fā)揮作用。
　　研究目的：
　　1.明確IL-20及其受體在支氣管哮喘上皮細胞及肺泡灌洗液中的表達水平，以及其表達水平是否與哮喘嚴重程度相關;
　　2.探討IL-20在支氣管哮喘中的作用及IL-20與Th2免疫應答的相關性;
　　3.探討IL-20在支

6、氣管哮喘氣道重塑中是否發(fā)揮促進氣道重塑的作用。
　　研究方法
　　1.首先為了明確IL-20及其受體在氣道上皮是否高水平表達，我們從支氣管哮喘患者(n=20)和正常人(n=20)分別獲取支氣管鏡活檢標本，并用特異性抗體分別對IL-20、IL-20受體1(IL-20R1)、IL-20受體2(IL-20R2)進行免疫組織化學染色。
　　2.其次為了研究IL-20在支氣管哮喘中與Th2免疫應答的關系，首先我們采集哮喘患者(n

7、=100)和正常人(n=100)靜脈血血清，采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測受試者血清中IL-20與IL-4、 IL-5、IL-13的水平，并分別進行IL-20與IL-4、IL-5、IL-13的相關性分析，同時，我們將哮喘患者分為輕、中、重三組，分析三組患者血清中IL-20表達水平是否有差異，以明確IL-20的表達水平是否與哮喘嚴重程度有關。
　　3.再次我們采用蘇木精-伊紅染色法(HE)染色觀察支氣管哮喘患者氣道黏膜上皮

8、的氣道重塑情況。為了明確IL-20在支氣管哮喘氣道重塑中的作用，我們首先將20只BALB/c小鼠隨機分為雞卵白蛋白(OVA)組和對照組，每組10只，OVA組制作小鼠哮喘模型，取兩組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，應用ELISA檢測BALF中IL-20表達水平，然后應用免疫組織化學染色技術檢測哮喘模型小鼠氣道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖連蛋白-1(FN-1)的在氣道上皮的表達水平

9、。為明確哮喘模型小鼠肺組織中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1是否高于正常對照組，我們應用western blot方法對哮喘模型小鼠肺組織在蛋白質水平上檢測IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表達情況。為進一步明確IL-20與α-SMA、FN-1有無直接關系，我們采用細胞培養(yǎng)進行體外試驗，采用小鼠肺上皮細胞-12(MLE-12)細胞進行細胞培養(yǎng)，用IL-20處理MLE-12細胞

10、，IL-20濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0ng/ml，應用westem blot方法檢測各濃度IL-20處理后的α-SMA、FN-1表達水平，并應用western blot方法檢測1.5ng/ml濃度的IL-20處理MLE-12細胞0、6、12、24h時α-SMA、FN-1以確定α-SMA、FN-1與IL-20有無劑量、時間依賴性，為進一步確定IL-20與α-SMA、FN-1之間有無因果關系，我們應用細胞轉染技術，采用IL-2

11、0-shRNA轉染MLE-12沉默IL-20的表達，采用westem blot方法檢測IL-20、α-SMA、FN-1表達情況。
　　研究結果：
　　1.首先通過對哮喘患者氣道黏膜活檢組織進行免疫組織化學染色的方法，我們發(fā)現支氣管哮喘患者氣道粘膜上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2的表達較對照組明顯升高（分別為:P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），具有顯著的統(tǒng)計學差異。
　　2.通過ELSIA方法檢

12、測我們檢測支氣管哮喘患者及健康對照血清中IL-20與IL-4、IL-5、IL-13，結果發(fā)現支氣管哮喘患者血清中IL-20與IL-4、IL-5、 IL-13具明顯高于健康對照組（分別為:P＜0.001，P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），同時我們將IL-20水平與IL-4、IL-5、IL-13水平進行了相關性分析，結果發(fā)現，IL-20水平的升高與IL-4、 IL-5、IL-13水平的升高具有顯著的正相關性（相關系數R2分別為

13、:0.809，0.783，0.752）。我們將100名哮喘患者分為輕、中、重三組，分析這三組患者血清中IL-20的水平有無差異，結果發(fā)現隨著患者病情嚴重程度的加重，患者血清中IL-20的水平逐漸升高，且三組中IL-20的表達水平與對照組及相互之間有明顯差異（分別為: P＜0.01，P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）。
　　3.通過HE染色，我們在哮喘患者氣道粘膜上皮中發(fā)現了明顯的氣道重塑的病理表現。在小鼠BALF的研究中，

14、我們發(fā)現與對照組小鼠BALF相比，哮喘模型小鼠BALF中IL-20的表達水平明顯升高(P＜0.01)，具有統(tǒng)計學意義。我們應用免疫組織化學染色染色發(fā)現哮喘模型小鼠氣道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表達明顯高于對照組（分別為:P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05）。通過western blot方法進一步確定了哮喘模型小鼠肺組織中IL-20、IL-20R1、IL-20

15、R2、α-SMA、FN-1的表達水平明顯高于對照組（分別為:P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01），均有統(tǒng)計學差異。IL-20處理MLE-12細胞后發(fā)現α-SMA、FN-1的表達水平明顯上調，并且發(fā)現α-SMA、FN-1的表達水平隨IL-20的濃度的增加而明顯上調，IL-20在1.5ng/ml濃度與MLE-12細胞共育6小時后，α-SMA、FN-1表達水平升高。應用IL-20-shRNA沉默IL-20的表

16、達，再次應用western blot檢測α-SMA、FN-1，結果發(fā)現α-SMA、FN-1的表達水平被明顯抑制了。
　　研究結論：
　　1.支氣管哮喘患者氣道黏膜上皮IL-20、IL-20R1、IL-20R2高表達。哮喘模型小鼠BALF中高表達IL-20。
　　2.哮喘患者血清中高表達IL-20與IL-4、IL-5、IL-13，且IL-20的升高與IL-4、IL-5、IL-13的升高呈正相關。說明IL-20與Th2免疫

17、應答存在明顯的正相關關系。
　　3.支氣管哮喘模型小鼠肺組織及氣道上皮中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、 FN-1高表達及HE染色均支持哮喘氣道上皮存在氣道重塑。應用westem blot方法進一步確定鼠肺組織中IL-20、IL-20R1、IL-20R2、α-SMA、FN-1的表達水平明顯高于正常對照組。用IL-20處理MLE-12細胞后發(fā)現α-SMA、FN-1表達升高，并且其升高與IL-20濃度存在劑量依