沉默Scinderin基因在骨肉瘤Saos2細胞中的相關功能研究.pdf

1、第一部分:沉默Scinderin基因在骨肉瘤Saos2細胞中的相關功能研究
　　目的
　　1)構建肌切蛋白(Scinderin，SCIN)基因 siRNA慢病毒載體，并轉染骨肉瘤Saos2細胞。
　　2)通過沉默SCIN基因在骨肉瘤Saos2細胞中的表達，觀察其對骨肉瘤Saos2細胞相關功能的影響。
　　方法
　　1)構建SCIN-siRNA慢病毒載體并轉染骨肉瘤Saos2細胞；
　　2)采用Real

2、 time-PCR及Western blot兩種方法檢測轉染后的Saos2細胞，分別在mRNA水平和蛋白水平檢測SCIN的沉默效率；
　　3)細胞增殖情況觀察：CCK-8法分別檢測siRNA-SCIN慢病毒載體的Saos2細胞（KD）、空白對照(NC)，以及轉染含無義序列的慢病毒載體為陰性對照(CON)三組細胞增殖能力；
　　4)細胞侵襲能力觀察：細胞劃痕實驗及 Transwell實驗分別觀察感染siRNA-SCIN慢病毒載

3、體的Saos2細胞（KD）、空白對照(NC)，以及轉染含無義序列的慢病毒載體為陰性對照(CON)三組細胞的轉移及侵襲能力變化。
　　結果
　　1)經鑒定確認慢病毒載體構建成功后，分別轉染入骨肉瘤 Saos2細胞，質粒攜帶有GFP綠色熒光蛋白基因，熒光顯微鏡下，轉染成功的細胞可見綠色熒光，鏡下觀察KD組及CON組，分別達到90%和85%以上帶有綠色熒光，證明細胞轉染成功。
　　2)通過Real-time PCR和West

4、ern-blot兩種實驗方法驗證沉默SCIN基因效率。結果顯示，siRNA-SCIN（KD）組細胞中 SCIN基因在 mRNA水平和蛋白水平均較CON及NC組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而CON與NC兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　3) CCK-8生長曲線觀察發(fā)現沉默SCIN基因，Saos2細胞的增殖能力較對照組明顯提高,與對照組自第2日起出現統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　4)細胞劃痕實驗提

5、示siRNA-SCIN(KD)組在24h，48h向劃痕中生長的距離和數量均較CON組及NC組細胞多，侵襲能力明顯提高，差異有明顯統(tǒng)計學差異（P<0．05及P<0．01)。
　　5) Transwell侵襲試驗結果顯示siRNA-SCIN(KD)組較CON及NC組的侵襲率顯著提高（P<0．05)。而CON與NC兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論
　　1)本組實驗成功的構建 siRN-SCIN慢病毒載體，并

6、成功轉染骨肉瘤 Saos2細胞，轉染后的Saos2細胞SCIN基因的表達明顯抑制。
　　2) SCIN基因的沉默使骨肉瘤Saos2細胞的增值率及轉移、侵襲率明顯提高，提示在高發(fā)遠處轉移的骨肉瘤患者腫瘤細胞中可能存在 SCIN基因的表達減少或缺乏。故SCIN基因過表達是否能成為預防骨肉瘤轉移及復發(fā)的一種治療手段值得進一步研究。
　　第二部分:166例兒童及青少年骨肉瘤患者臨床特點比較及預后影響因素分析
　　目的
　

7、　比較兒童骨肉瘤與青年骨肉瘤臨床特點差異，探討影響預后的相關因素。
　　方法
　　1)回顧2003年10月至2012年3月間收治并確診為骨肉瘤的166例19歲以下兒童及青年患者的病例資料，并對其預后進行隨訪，隨訪時間3～103個月，平均53.0個月，根據年齡將其分為兒童骨肉瘤(≤14歲)及青年骨肉瘤(14～19歲)兩組，比較兩組患者之間臨床特點的差異;應用Kaplan—Meier法計算患者生存率。
　　2)以性別、年齡

8、、KPS評分、腫瘤生長部位、腫瘤體積大小、Enneking外科分期、病理性骨折、手術方式、新輔助化療、術后輔助化療次數、局部復發(fā)及遠處轉移12項因素為變量指標，應用Log—rank檢驗進行單因素分析，應用 Cox回歸模型進行多因素分析，研究這些因素與骨肉瘤患者生存率之間的關系。
　　3)以卡方檢驗比較新輔助化療與手術方式、新輔助化療與肺內轉移、新輔助化療與局部復發(fā)、手術方式與局部復發(fā)之間的關系。同時觀察積極治療肺轉移對預后的影響。

9、
　　結果
　　1)166例骨肉瘤患者中位生存時間為31.0個月（95%可信區(qū)間22.0-40.0個月），累計1年，2年和3年生存率分別為90±2%、59±4%和45±4%。
　　2)兒童骨肉瘤與青年骨肉瘤相比，前者更多接受截肢手術治療（P=0.010）。兩組在性別、Enneking外科分期、KPS評分、病理性骨折、腫瘤壞死率、病理分型、腫瘤部位、輔助化療次數及腫瘤體積大小差異無統(tǒng)計學意義。
　　3)單因素統(tǒng)計分

10、析顯示骨肉瘤有效預后因素有6個，分別為 KPS評分、Enneking外科分期、是否接受新輔助化療、術后輔助化療次數（≥6次與<6次）、術后有無復發(fā)、是否伴有遠處轉移。
　　4)多因素統(tǒng)計分析顯示KPS評分、術后輔助化療次數及是否伴有遠處轉移是影響預后的獨立因素。
　　5)卡方檢驗顯示新輔助化療與保肢率相關，而與肺轉移，局部復發(fā)無關。手術方式與局部復發(fā)之間無相關性；然而積極處理肺部轉移灶對生存有明顯影響（P=0.000）。