CD40信號聯(lián)合細胞因子體外制備過繼免疫治療細胞的實驗研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴重危害人類的健康,雖然手術(shù)、化療和放療等治療手段不斷改進提高,但是仍有很多患者遭罹腫瘤的復發(fā)。從腫瘤生物/免疫治療方面來打開突破口,尋找優(yōu)化的綜合治療方案,是現(xiàn)代腫瘤治療的新途徑。腫瘤疫苗、單克隆抗體治療、細胞因子等佐劑治療和過繼性細胞免疫治療是近來比較常用的腫瘤免疫治療方法。腫瘤過繼性細胞免疫治療(Adoptive cellular immunotherapy,ACI或AIT)是指將體外擴增的具有抗腫瘤活性的免疫細胞(包括特

2、異性的和非特異性的)向腫瘤患者回輸,直接或間接激發(fā)機體免疫應(yīng)答以殺傷腫瘤細胞,這對細胞免疫功能低下的患者特別適用,其主要的原理是在體外分離得到患者外周血單個核細胞,經(jīng)過特異性抗原作用和實驗室培養(yǎng)后具備了特異性或非特異性殺傷腫瘤的能力,之后將這種細胞擴增到一定數(shù)量再回輸?shù)交颊唧w內(nèi),以預防腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移,這在一定程度上解決了患者放、化療后免疫力差,生活質(zhì)量低的嚴重問題,延長了患者的生存時間。目前,多種細胞因子誘導的殺傷性細胞(cytoki

3、nes induced killers,CIK)已經(jīng)用于多種惡性腫瘤的輔助治療,因其兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限制性殺瘤特點,被認為是腫瘤過繼免疫治療的希望,但其臨床應(yīng)用依然存在著一些亟待解決的問題,進一步發(fā)掘過繼免疫治療細胞潛在的抗腫瘤優(yōu)勢,對于提高腫瘤過繼性細胞免疫治療在腫瘤綜合治療中的地位意義深遠,因此本研究運用本所自主研制的CD40激發(fā)型抗體5C11聯(lián)合細胞因子IFN-α和IL-7體外制備一種新型過繼免疫

4、治療細胞,從細胞增殖、細胞生物學特性和細胞的殺傷效應(yīng)等方面探討其過繼免疫治療的作用,以期為腫瘤過繼性細胞免疫治療開辟一種新的方案。
　　目的：比較新型方法(CD40激發(fā)組)與傳統(tǒng)方法(CD3激發(fā)組)培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞在增殖速度、細胞亞群和生物學特性(T細胞、NK-T細胞、單核細胞、Treg/ICOS+Treg細胞和表達PD-1、CXCR-4的T細胞等)以及體外趨化能力和殺傷腫瘤細胞能力等方面的差異,以期建立體外培養(yǎng)過繼免疫治療

5、細胞的優(yōu)化方案。
　　方法：常規(guī)經(jīng)Ficoll分離正常人外周血得到外周血單個核細胞(PBMC),于6孔板和24孔板中加入相應(yīng)細胞因子(CD40激發(fā)組:CD40激發(fā)型單抗5C11,IFN-α, IL-7;CD3激發(fā)組:IFN-γ,IL-2,anti-CD3mAb,IL-1α)后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔兩天補一次細胞因子液。在培養(yǎng)的不同時間點(第6、9、12天)記錄細胞形態(tài)并用臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)以檢測細胞增殖。在培養(yǎng)的不同時間點

6、,運用免疫熒光標記和流式細胞儀分析檢測T細胞、NK細胞、NKT細胞、CD14+CD56+CD11c+細胞比例,檢測T細胞表達CD62L、CCR7、CXCR-4以及PD-1的變化以及Treg和ICOS+Treg細胞的表達比例。收集培養(yǎng)第9天的細胞,利用Transwell板檢測體外培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞的體外趨化能力。在培養(yǎng)的第9天收集兩組體外培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞,將其與人肺癌細胞株A549按照不同的效靶比共同培養(yǎng)72小時后,用CCK-8

7、法檢測體外培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞殺傷腫瘤細胞的能力。
　　結(jié)果：⑴CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細胞都出現(xiàn)明顯的集落樣生長,CD40激發(fā)組細胞增殖速度略慢,但二者沒有顯著性差異;⑵CD3激發(fā)組和CD40激發(fā)組細胞在T淋巴細胞組成上無顯著差異,CD40激發(fā)組的NK-T細胞表達顯著上調(diào),中央型記憶CD8+T細胞(CD8+TCM)的比例增加,并且在培養(yǎng)的特定時間出現(xiàn)了獨特的CD14+CD56+CD11c+細胞群體;⑶和 CD3激發(fā)組相比,

8、CD40激發(fā)組的Treg細胞、ICOS+Treg細胞和表達PD-1的T細胞比例顯著降低;⑷CD40激發(fā)組培養(yǎng)的過繼免疫治療細胞在第9天時,體外趨化能力強,并且對人肺癌細胞株A549細胞的殺傷活性不亞于CD3激發(fā)組。
　　結(jié)論：本實驗所建立的新型過繼免疫治療細胞體外培養(yǎng)方法能提高培養(yǎng)細胞中NK-T細胞的比例,顯著減少Treg細胞的數(shù)量,并且在培養(yǎng)的特定時間出現(xiàn)了獨特的CD14+CD56+CD11c+細胞群體,為腫瘤過繼免疫治療新方案