DHBV分子流行病學調查及雛鴨人工感染DHBV疾病模型的建立與初步應用.pdf

1、959。12r：J’。：一分類號一世12墅：一四川農業(yè)大學碩：士一i。學一一位論文、～、，’一DHBV分子流行病學調查及雛鴨人工感染、、一一一，、^～一、一一一。～?！痡’‘DHBV一：疾病模型的建立與初步應用’，一‘一一指導教師，，一一j徐大為一’|‘。學科專業(yè)：囂隨羞醫(yī)堂一諺l『究方舟。，，。麴簟蘊睪堂，哼2006年6月摘要本研究根據GenBank中登錄的鴨乙型肝炎病毒(DuckhepatitisBvirus，DHBV)的全基因序列

2、，建立了常規(guī)PCR和熒光定量PCR兩種檢測DHBV方法，分別用于DHBV分子流行病學調查和人工感染DHBV疾病模型的建立。并利用建立的疾病模型篩選和評估抗乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)新藥物的研究。針對DHBV的保守序列設計1對引物，建立了PCR檢測方法，采用該方法檢測含DHBV樣品能夠擴增出215bp預期大小的片段。該方法對鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨源致病性大腸埃希氏菌、鴨源致病性沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌等

3、感染鴨的常見病原都呈陰性反應；檢測DHBV核酸的靈敏度可達042pg，對天府肉鴨血清檢測的陽性率為1234％(38／326)。該法特異強、靈敏性高，可用于DHBV的快速診斷和分子流行病學調查。針對DHBV的P基因上的保守序列設計并合成引物和熒光標記探針，建立了實時熒光定量聚合酶鏈反應(fluorsescencequantitativepolymerasechainreaction，FQPCR)檢測方法。建立的標準曲線循環(huán)閾值(cycle

4、threshold，Ct值)與模板濃度具有良好的線性關系，相關系數為0996，最低可檢N5copies／L的DHBV—DNA，即相當于5個DHBV顆粒。該方法較常規(guī)PCR技術更為簡便、快速、準確，靈敏度高100倍。用不同劑量的DHBV陽性血清經不同感染途徑人工感染1日齡天府肉鴨(DHBV為陰性)，于感染后2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、19d、22d、26d、31d、37d、44d、52d、60d、70d分別殺鴨

5、無菌取血和肝組織，用所建立的FQ—PCR方法檢測肝臟和外周血中DHBV—DNA的含量。結果感染后48h可從外周血和肝組織中檢測出DHBVDNA，N70天仍可檢測出較高水平的DHBV—DNA：肝組織中DHBV—DNA含量的整體水平比外周血中高，維持時間也較長。外周血和肝組織中的DHBVDNA水平與感染劑量呈正相關，并表現出一定的劑量依賴性。天府肉鴨對DHBV敏感，用DHBV陽性血清感染1日齡天府肉鴨可建立DHBV疾病感染模型。用天府肉鴨D