乳腺癌EphA2，EphrinA1，ERα，ERβ和PR的表達(dá)及RNAi沉默EphA2基因的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一,已位居女性腫瘤死亡首位,全球每年約有120余萬(wàn)婦女患乳腺癌,約50萬(wàn)婦女死于乳腺癌。其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)呈較快增長(zhǎng)趨勢(shì),每年約以0.2～0.3％的速度遞增,且發(fā)病年齡趨向年輕化；已經(jīng)證實(shí),年齡、疾病分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況和腫瘤微血管密度等臨床病理學(xué)因素與腫瘤預(yù)后密切相關(guān),且早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是腫瘤致死的主要因?yàn)?。因?迫切需要尋找一個(gè)敏感、能早期預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子生物

2、學(xué)標(biāo)志物及抑制其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的基因治療靶點(diǎn),為臨床對(duì)乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測(cè)提供一定的參考依據(jù)。
　　 乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與人體內(nèi)雌激素的增加、孕激素的減少密切相關(guān),性激素的代謝素紊亂促進(jìn)了某些乳腺癌的生長(zhǎng),但其確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。新近在對(duì)乳腺癌細(xì)胞中EphA2表達(dá)狀況的研究中,越來(lái)越多的證據(jù)表明EphA2與ER之間存在相互影響。但是對(duì)于EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR在乳腺癌中的聯(lián)合檢測(cè),國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道

3、。
　　 新輔助化療是對(duì)非轉(zhuǎn)移性腫瘤局部治療之前進(jìn)行的全身性、系統(tǒng)性細(xì)胞毒性藥物治療。目前新輔助化療已成為局部晚期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療。國(guó)際上關(guān)于乳腺癌新輔助化療的多中心隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:新輔助化療與輔助化療同樣有效。對(duì)新輔助化療敏感的乳腺痛比不敏感者預(yù)后好,特別是在局部進(jìn)展期乳腺癌的應(yīng)用中已取得良好的效果。新輔助化療后許多病理學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)都發(fā)生了改變,很多基因表達(dá)均發(fā)生了改變。尋找出能夠預(yù)測(cè)新輔助化療療效并幫助選擇內(nèi)分泌治療

4、、化療方案、判斷乳腺癌預(yù)后的腫瘤分子標(biāo)記物已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)之一,對(duì)于EphA2及ER、PR在新輔助化療前后乳腺癌中的表達(dá)的研究,國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。
　　 我們通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)了EphA2、EphrinA1及ERα、ERβ、PR的蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及各自與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)EphA2和ER、PR在新輔助化療前后的乳腺癌組織中的表達(dá)情況；用RT-PCR技術(shù)研究了EphA2及其配體Ephr

5、inA1各自的mRNA在乳腺癌中的表達(dá)及各自與臨床病理學(xué)因素的關(guān)系；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)抑制EphA2在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá),以期尋找出能幫助選擇有效治療方案及預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的有效指標(biāo),并探討EphA2在乳腺癌中的作用機(jī)制及預(yù)后價(jià)值,以期為乳腺癌的基因治療提供新的思路。本研究分為四章:
　　 第一章 乳腺癌中EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR蛋白的表達(dá)及其意義
　　 目的
　　

6、研究EphA2,EphrinA1及ERα,ERβ,PR等的蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其意義。
　　 方法
　　 1.用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)130例乳腺痛組織中EphA2,EphrinA1,ERα,ERβ及PR等各自蛋白的表達(dá)水平及其與臨床病理因素的關(guān)系。
　　 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:用spss13.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)所有資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用卡方檢驗(yàn)(chi-square),t(studert t)

7、檢驗(yàn),方差分析(ANVOA),相關(guān)性檢驗(yàn)等。顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。
　　 結(jié)論
　　 1.在乳腺癌組織中檢測(cè)到EphA2、EphrinA1、ERα、ERβ和PR的蛋白的表達(dá),提示他們可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。
　　 2.EphA2蛋白在乳腺癌的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān),EphrinA1蛋白在乳腺癌的表達(dá)與臨床分期、組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān),ERβ蛋白在乳腺癌的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)相關(guān),提示其潛在

8、的預(yù)后價(jià)值并有可能成為乳腺癌預(yù)后評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物。EphA2蛋白高表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示其可能參與乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。
　　 3.EphA2和EphrinA1在乳腺癌中的蛋白表達(dá)分布的一致性提示在乳腺癌中,EphrinA1是EphA2受體的主要配體之一,二者可能在乳腺癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。EphA2和EphrinA1共同定位于腫瘤細(xì)胞和乳腺癌的血管內(nèi)皮細(xì)胞,提示二者可能協(xié)同參與了乳腺癌的血管生成,二者有望成為

9、乳腺癌基因治療的新靶向。
　　 4.乳腺癌組織中有較高的ERα蛋白和ERβ蛋白陽(yáng)性表達(dá),提示乳腺癌是性激素依賴(lài)性腫瘤,可根據(jù)受體的含量指導(dǎo)臨床進(jìn)行內(nèi)分泌治療。
　　 5.乳腺癌細(xì)胞EphA2與EphrinA1的表達(dá)顯著相關(guān),提示EphrinA1的表達(dá)受EphA2誘導(dǎo),EphrinA1可以通過(guò)自分泌和/或旁分泌環(huán)作用于相應(yīng)的EphA2受體促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及血管形成。
　　 6.在乳腺癌中,EphA2蛋白的表達(dá)與ERα

10、蛋白負(fù)相關(guān),和ERβ蛋白正相關(guān)相關(guān),提示ERα可能副性調(diào)控EphA2的表達(dá),而ERβ可能正性調(diào)控EphA2的表達(dá)。
　　 7.EphA2和EphrinA1的檢測(cè)可作為乳腺癌預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。
　　 第二章 EphA2、ER、PR在新輔助化療前后乳腺癌中的表達(dá)及意義
　　 目的
　　 研究乳腺痛中ER、PR 和EphA2的表達(dá)在新輔助化療前后的變化及臨床意義。
　　 方法
　　 采用免疫組化S

11、P法檢測(cè)ER、PR和EphA2在52例新輔助化療前后的乳腺癌組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)論
　　 新輔助化療能抑制腫瘤細(xì)胞增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,顯著降低EphA2的陽(yáng)性表達(dá),而對(duì)ER、PR的表達(dá)無(wú)顯著影響。
　　 第三章 乳腺癌中EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA的表達(dá)及其意義
　　 目的
　　 研究EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA在乳腺癌中的表達(dá)及其意義。

12、　　 方法
　　 1.選擇40例乳腺癌冰凍標(biāo)本,分別經(jīng)免疫組化證實(shí)有不同級(jí)別的EphA2蛋白表達(dá)和EphrinA1蛋白表達(dá),用于RNA提取。
　　 2.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分別檢測(cè)其中EphA2mRNA和EphrinA1mRNA的表達(dá),比較各自mRNA與其蛋白表達(dá)的相關(guān)性及與臨床病理因素的關(guān)系。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均經(jīng)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。應(yīng)用t檢驗(yàn)(

13、t-test)；方差分析(One-Way ANVOA)；非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis test法)；顯著性標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。
　　 結(jié)論
　　 1.乳腺癌癌組織中EphA2 mRNA的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均顯著相關(guān)(P=0.000)；EphrinA1 mRNA的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)(P=0.000)；提示EphA2 mRNA的陽(yáng)性表達(dá)和EphrinA 1 mRNA的陽(yáng)

14、性表達(dá)均與乳腺癌的惡性行為相關(guān),有可能成為乳腺癌預(yù)后的標(biāo)記物。
　　 2.EphA2mRNA、EphrinA1mRNA的陽(yáng)性表達(dá)與各自蛋白質(zhì)的表達(dá)具有一定的相關(guān)性,提示乳腺癌組織中二者主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。
　　 3.EphA2 mRNA和EphrinA1 mRNA表達(dá)水平分別與各自蛋白表達(dá)水平的不完全一致,提示二者在乳腺癌中存在某種轉(zhuǎn)錄后翻譯水平的調(diào)控機(jī)制和蛋白質(zhì)積聚或降解通路障礙。
　　 第四章 RNAi靶向沉

15、默乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中EphA2的表達(dá)的研究
　　 目的
　　 探討逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中EphA2表達(dá)的影響。以期為乳腺癌的基因治療提供新的思路和手段、
　　 方法
　　 1.根據(jù)人EphA2mRNA基因編碼區(qū)序列,按照序列設(shè)計(jì)原則及網(wǎng)上軟件,設(shè)計(jì)并合成兩條互補(bǔ)的編碼EphA2shRNA的寡核苷酸序列。
　　 2.兩條互補(bǔ)的編碼EphA2shRNA的寡核苷酸鏈煺火

16、后與線(xiàn)性載體質(zhì)粒RNAi-READY-pSIREN-RetroQ連接,構(gòu)建形成重組質(zhì)粒pSIREN-RetroQ-EphA2,同時(shí)用試劑盒提供的陰性對(duì)照siRNA雙鏈寡核苷酸構(gòu)建對(duì)照載體pSIREN-RetroQ-C。
　　 3.以重組質(zhì)粒pSIREN-RetroQ-EphA2轉(zhuǎn)化大腸桿菌。用堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA,然后進(jìn)行酶切鑒定和DNA測(cè)序分析。
　　 4.脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到包裝病毒細(xì)胞株P(guān)A317中,并進(jìn)行克隆

17、與篩選。
　　 5.以重組質(zhì)粒pSIREN-RetroQ-EphA2轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞,并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆。
　　 6.Westen-blot檢測(cè)EphA2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 1.從EphA2 mRNA序列中篩選出有效的siRNA序列,并設(shè)計(jì)了互補(bǔ)雙鏈寡核苷酸發(fā)夾結(jié)構(gòu),成功構(gòu)建了EphA2 siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,并將之轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞。
　　 2.通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病