RIZ1真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制.pdf

1、[目的]
　　建立人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，將RIZ1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤，探討RIZ1真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用
　　[方法]
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　常規(guī)方法復(fù)蘇人食管癌TE13細(xì)胞株，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)傳代。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)問及數(shù)量達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞收取及細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　2、建立人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤模型及

2、實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)
　　BALB/c裸鼠在SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)觀察三天后，裸鼠一般狀況良好，于第四日將收集好處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌TE13細(xì)胞由同一人于裸鼠同一部位（右側(cè)腋窩）進(jìn)行接種。接種后觀察裸鼠一般狀況及腫瘤生長(zhǎng)情況。
　　當(dāng)裸鼠腫瘤平均直徑約為0.5cm時(shí)（注射細(xì)胞懸液后第15天），舍去移植瘤體積最大和最小的兩只裸鼠，將剩余裸鼠用隨機(jī)數(shù)字法分成3組，每組5只。具體分組如下:①空白對(duì)照組:給予生理鹽水100μl/次;②空

3、質(zhì)粒組:脂質(zhì)體20μl+空質(zhì)粒20μg，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整液體總量至100μl/次;③pcDNA3.1(+)/RIZ1實(shí)驗(yàn)組;脂質(zhì)體20μl+RIZ1真核表達(dá)質(zhì)粒20μg，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整液體總量至100μl/次。三組均采用瘤內(nèi)多點(diǎn)注射，隔兩天1次，共5次。
　　3、應(yīng)用RT-PCR、Western blot技術(shù)檢測(cè)RIZ1 mRNA及其蛋白的表達(dá)
　　處死裸鼠后，提取裸鼠移植瘤組織中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應(yīng)用

4、RIZ1引物進(jìn)行半定量PCR反應(yīng)以擴(kuò)增出基因組的RIZ1以及GAPDH，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。提取裸鼠腫瘤組織中蛋白，利用Western blot技術(shù)對(duì)提取的樣品電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)后，用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色、照相。
　　4、人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤形態(tài)學(xué)觀察
　　觀察裸鼠一股狀況及移植瘤生長(zhǎng)變化;測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)、短徑，計(jì)算腫瘤體積;處死裸鼠后，剝離腫瘤、稱取瘤重，將瘤體組織進(jìn)行HE染色。
　　[結(jié)果]<

5、br>　　1、成功構(gòu)建人食管痛TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤模型
　　接種細(xì)胞一周后觀察有所有裸鼠均有瘤體生成，且生長(zhǎng)速度較快，15天后觀察裸鼠腫瘤平均直徑可達(dá)0.5cm，測(cè)量瘤體平均體積在100mm3左右，腫瘤移植成功率達(dá)100％。瘤體組織HE染色結(jié)果顯示其具有腫瘤細(xì)胞的特征。
　　2、RIZ1基因在人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤中的表達(dá)
　　移植瘤中提取的RNA經(jīng)RT-PCR后，產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示:pcDNA3.1(+)/R

6、IZ1實(shí)驗(yàn)組在100bp～200bp之間出現(xiàn)清晰條帶，其大小與理論預(yù)期值(167bp)一致。應(yīng)用Western blot檢測(cè)各組內(nèi)RIZ1蛋白的差異，結(jié)果顯示:pcDNA3.1(+)/RIZ1實(shí)驗(yàn)組可見明顯RIZ1蛋白表達(dá)，而空白對(duì)照組與空質(zhì)粒組RIZ1蛋白成低表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，pcDNA3.1(+)/RIZ1實(shí)驗(yàn)組RIZ1 mRNA及RIZ1蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);空白對(duì)照

7、組與空質(zhì)粒組RIZ1 mRNA及RIZ1蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　3、RIZ1真核表達(dá)質(zhì)粒對(duì)人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用
　　最后一次注射RIZ1真核表達(dá)質(zhì)粒后第7天處置各組裸鼠，空白對(duì)照組、空質(zhì)粒組、pcDNA3.1(+)/RIZ1實(shí)驗(yàn)組瘤體平均體積(cm3)分別為:(2.208±0.085)，(2.098±0.089)，(1.025±0.018)。瘤體平均重量(g)為:（

8、2.334±0.101），（2.188±0.082），（1.041±0.063）。pcDNA3.1(+)/RIZ1實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積及重量明顯小于空白對(duì)照組及空質(zhì)粒組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(P＜0.05);空白對(duì)照組與空質(zhì)粒組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。抑瘤率為53.6％。
　　[結(jié)論]
　　1.應(yīng)用人食管癌TE13細(xì)胞可以建立人食管癌裸鼠移植瘤模型
　　2.對(duì)人食管癌TE13細(xì)胞裸鼠移植瘤進(jìn)行脂質(zhì)體介導(dǎo)pcD