抗轉(zhuǎn)鐵蛋白受體抗體新型分子的構(gòu)建.pdf

1、目的：利用抗TfR抗體能與腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的TfR結(jié)合的特點(diǎn)，構(gòu)建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒，觀測其靶向腫瘤效應(yīng)。利用多聚陽離子多聚乙酰亞胺（PEI）能夠耦聯(lián)帶負(fù)電荷DNA的特點(diǎn)，構(gòu)建末端帶陰性寡肽尾的抗TfR-scFv-D4S×5雙功能分子與PEI/DNA結(jié)合。鑒定這類抗TfR抗體新型分子與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性和生物學(xué)活性，為腫瘤的靶向定位、示蹤、顯像和靶向治療研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　

2、　 1.抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒的構(gòu)建：①運(yùn)用飽和硫酸銨沉淀法純化抗TfR mAb，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE鑒定其純度，F(xiàn)CM鑒定其與TfR的結(jié)合活性；②Traut's試劑活化抗TfR mAb二硫鍵，與帶有DSPE-PEG(2000)-Maleimide雙功能基團(tuán)的PEG/DIR-BOA納米顆?；旌戏跤瑯?gòu)建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒。
　　 2.FPLC純化

3、PEG/DIR-BOA納米顆粒和抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒，去除游離雜質(zhì)。
　　 3.利用抗TfR mAb，F(xiàn)CM技術(shù)檢測不同細(xì)胞（CHO、L02、HepG2、HT1080）表面TfR的表達(dá)，利用PEG/DIR-BOA納米顆粒具有能與細(xì)胞表面SRBⅠ結(jié)合的多肽，F(xiàn)CM技術(shù)檢測不同細(xì)胞(HepG2、HT1080)表面SRBⅠ的表達(dá)。
　　 4.利用腫瘤細(xì)胞HT1080表面TfR和SRBⅠ的表達(dá)特點(diǎn)

4、，F(xiàn)CM檢測抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒與腫瘤細(xì)胞HT1080的靶向結(jié)合活性。
　　 5.利用生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)，采用重疊延伸PCR全合成適合于大腸桿菌表達(dá)的基因，通過酶切、連接等基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)和構(gòu)建不同表達(dá)載體的抗TfR-scFv-D4S×5質(zhì)粒：①pET28a-6×His-scFv-D4S×5；②pET28a-scFv-D4S×5-6×His；③pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×Hi

5、s；④pAB1-scFv-D4S×5-6×His。
　　 6.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，原核表達(dá)抗TfR-scFv-D4S×5，12％SDS-PAGE、Western-blot 鑒定不同表達(dá)載體蛋白表達(dá)。
　　 7.常規(guī)提取可溶性蛋白或溶解包涵體，采用Ni-NTA agrose純化蛋白，收集純化產(chǎn)物經(jīng)12％SDS-PAGE、Western-blot分析鑒定。
　　 8.包涵體純化產(chǎn)物透析復(fù)性。
　　 9.FCM檢測

6、抗TfR-scFv-D4S×5與腫瘤細(xì)胞HepG2、K562結(jié)合活性。
　　 10.FCM檢測抗TfR-scFv-D4S×5在腫瘤細(xì)胞K562的內(nèi)吞效率，熒光顯微鏡檢測內(nèi)吞活性。
　　 11.非變性梯度凝膠電泳鑒定抗TfR-scFv-D4S×5與PEI/DNA的結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.BCA法測定抗TfR mAb蛋白濃度約為7.5mg/mL，SDS-PAGE在55KD和25KD處可見明顯條帶，

7、與理論值相符，且產(chǎn)物純度可以達(dá)到90％以上。
　　 2.FCM檢測，抗TfR mAb與腫瘤細(xì)胞HepG2的結(jié)合率可達(dá)到90％左右，說明抗TfR mAb能與高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合。
　　 3.FCM檢測發(fā)現(xiàn)，CHO細(xì)胞不表達(dá)TfR，L02細(xì)胞TfR表達(dá)量相對較低約為16.3％左右，腫瘤細(xì)胞HepG2和HT1080表達(dá)量相對較高，分別為90％和67％左右。FCM檢測同時發(fā)現(xiàn)，HT1080細(xì)胞表面SRBⅠ表達(dá)量相對較

8、低約為2.9％左右，而HepG2細(xì)胞表面表達(dá)量相對較高，約為60％左右。
　　 4.FCM檢測發(fā)現(xiàn)，缺乏TfR靶向性的PEG/DIR-BOA納米顆粒與腫瘤細(xì)胞HT1080結(jié)合率僅為2.9％左右，而抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒與高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞HT1080結(jié)合率提高約3倍，為9.5％左右，封閉HT1080表面TfR，抑制抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA納米顆粒與TfR結(jié)合發(fā)現(xiàn)其結(jié)合率下降至3.

9、6％。
　　 5.提取pET28a-6×His-scFv-D4S×5質(zhì)粒，Nde I、BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果可見約828bp和5300bp片段，與預(yù)期值符合；提取pAB1-scFv-D4S×5-6×His質(zhì)粒，NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切，結(jié)果可見約819bp和3000bp左右片段，與預(yù)期值符合。測序分析結(jié)果分別與預(yù)期匹配，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。
　　 6.37℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化了pE

10、T28a-6×His-scFv-D4S×5表達(dá)載體的BL21菌，經(jīng)12％SDS-PAGE和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，在31KD處有目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在。經(jīng)Ni-NTA agrose純化，12％SDS-PAGE檢測純化成功，BCA法測定復(fù)性后蛋白濃度約為2mg/ml。
　　 7.37℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化了pET28a-scFv-D4S×5-6×His表達(dá)載體的B

11、L21菌，經(jīng)12％SDS-PAGE和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，在31KD處有目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在。經(jīng)Ni-NTA agrose純化，12％SDS-PAGE檢測純化成功。
　　 8.37℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化了pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×His表達(dá)載體的BL21菌，經(jīng)12％SDS-PAGE和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，在55KD處有攜帶

12、GST標(biāo)簽?zāi)康牡鞍卓筎fR-scFv-D4S×5成功表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物大部分以包涵體的形式存在。Ni-NTA agrose純化，12％SDS-PAGE檢測純化成功。25℃誘導(dǎo)12h表達(dá)條件下，12％SDS-PAGE和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，在55KD處有攜帶GST標(biāo)簽?zāi)康牡鞍卓筎fR-scFv-D4S×5成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物可溶性蛋白有增加，但包涵體表達(dá)仍相對較多。
　　 9.37℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化了pAB1-sc

13、Fv-D4S×5-6×His表達(dá)載體的BL21菌，經(jīng)12％SDS-PAGE和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)，在34KD處有攜帶信號肽的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5成功表達(dá)。25℃誘導(dǎo)表達(dá)條件下，表達(dá)產(chǎn)物中可溶性蛋白表達(dá)稍有增加，但包涵體表達(dá)仍相對較多。
　　 10.比較pET28a-6×His-scFv-D4S×5和pET28a-scFv-D4S×5-6×His表達(dá)載體BL21菌誘導(dǎo)表達(dá)的包涵體蛋白復(fù)性后的抗TfR-

14、scFv-D4S×5，pGEX4T3-GST-scFv-D4S×5-8×His誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白抗TfR-scFv-D4S×5三類不同表達(dá)載體表達(dá)的抗TfR-scFv-D4S×5活性，F(xiàn)CM檢測發(fā)現(xiàn)，pET28a-6×His-scFv-D4S×5表達(dá)載體BL21菌表達(dá)的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5能與高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞HepG2結(jié)合，結(jié)合率可達(dá)到80％左右，而另外兩類表達(dá)載體表達(dá)的抗TfR-scFv-D4S×5幾乎沒有結(jié)

15、合活性。
　　 11.FCM檢測發(fā)現(xiàn)，pET28a-6×His-scFv-D4S×5表達(dá)載體BL21菌表達(dá)的目的蛋白抗TfR-scFv-D4S×5同時能與高表達(dá)TfR的腫瘤細(xì)胞K562結(jié)合，結(jié)合率可達(dá)到80％左右。熒光顯微鏡觀察進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抗TfR-scFv-D4S×5與TfR特異性結(jié)合后在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下進(jìn)入細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測內(nèi)吞率可達(dá)到42.6％。
　　 12.非變性梯度凝膠電泳證明，在多聚陽離子多聚乙酰亞胺（PE

16、I）介導(dǎo)的靜電作用下，這種末端攜帶陰性寡肽尾的抗TfR-scFv-D4S×5雙功能分子能與PEI/DNA結(jié)合，具備耦聯(lián)帶負(fù)電荷DNA的特點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建抗TfR mAb-PEG/DIR-BOA靶向納米顆粒，并證明其具有與腫瘤細(xì)胞HT1080表面TfR的靶向結(jié)合活性，為TfR受體介導(dǎo)的腫瘤靶向定位、示蹤、顯像、靶向治療研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 2.利用生物信息學(xué)分析設(shè)計(jì)，采用重疊延伸PCR