RNA干擾沉默缺氧誘導因子HIF-1α基因治療骨肉瘤的實驗研究.pdf

1、一.HIF-1α在骨肉瘤中的表達及意義 目的:探討缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)在骨肉瘤中的表達及臨床意義。 方法:采用免疫組織化學方法(SP法)，檢測了48例骨肉瘤和10例正常骨組織中HIF-1α和VEGF的表達，分析兩種基因表達的相關性，并對有關臨床和病理指標綜合分析。 結果:HIF-1α在骨肉瘤中表達陽性率為43.8％，而正常骨組織中均為陰性表達；HIF-1α和VEGF基因表達之間顯著正相關(x2=4.

2、769,P=0.029)；HIF-1α的表達與年齡、性別、腫瘤的體積大小、Dahlin分型無關(P＞.05)，而與骨肉瘤臨床分期、軟組織浸潤以及Price分級密切相關(P＜0.05)。 結論：HIF-1α的高表達參與了骨肉瘤的惡性進展，可能通過刺激VEGF表達促進缺氧環(huán)境下骨肉瘤的血管新生，可作為新的分子靶點應用于骨肉瘤診斷、基因治療和預后判斷。 二.缺氧對骨肉瘤SaOS-2細胞生物學特性的影響 目的:觀察體外缺

3、氧條件下骨肉瘤SaOS-2生物學特性的改變。 方法:建立骨肉瘤細胞體外缺氧培養(yǎng)模型。流式細胞儀分析細胞周期改變。劃痕損傷法和Boyden侵襲小室檢測細胞體外侵襲遷移能力的變化。觀察缺氧培養(yǎng)不同時相(8h，16h，24h)HIF-1α和VEGF的表達。半定量RT-PCR方法檢測HIF-1α和VEGFmRNA的轉錄水平，免疫組化(SP法)檢測骨肉瘤細胞中HIF-1α和VEGF蛋白表達情況，BLISA法檢測培養(yǎng)上清中VEGF蛋白表達。

4、 結果:缺氧培養(yǎng)16h內(nèi)，細胞周期表現(xiàn)為G1期阻滯。24小時后，細胞周期恢復常氧狀態(tài)。缺氧培養(yǎng)24h后，骨肉瘤細胞體外遷移和侵襲能力明顯增強。缺氧處理后，HIF-1αmRNA轉錄水平?jīng)]有明顯改變，蛋白表達升高。VEGFmRNA以及蛋白的表達在缺氧條件下均顯著增強。 結論:骨肉瘤細胞存在缺氧耐受機制，通過一系列生物學特性的改變來應對缺氧帶來的不利。 三.HIF-1α短發(fā)夾狀小RNA干擾載體的構建及鑒定 目的

5、:構建低氧誘導因子HIF-1α發(fā)夾狀小干涉RNA真核表達載體，觀察發(fā)夾狀雙鏈小干涉RNA對骨肉瘤細胞HIF-1α的轉錄后的基因沉默效果。 方法:體外合成兩對互補的寡核苷酸鏈，分別針對缺氧誘導因子HIF-1αmRNA序列的兩個靶位點。退火形成雙鏈，插入pSilencerTMneoU62.1真核表達載體。將構建好的載體經(jīng)脂質(zhì)體介導轉染骨肉瘤SaOS-2細胞，觀察HIF-1α基因的沉默效果。半定量RT-PCR檢測HIF-1αmRNA的

6、抑制程度，免疫熒光和免疫印跡(WesternBlot)檢測HIF-1α蛋白表達情況。 結果:測序證實成功構建HIF-1α發(fā)夾狀小干涉RNA真核表達載體。轉錄生成的發(fā)夾狀小干涉能夠特異抑制HIF-1α表達。RT-PCR結果顯示針對HIF-1αmRNA序列的兩個靶位點的沉默效果分別為69％和92％，免疫熒光顯示轉染后熒光強度顯著降低，免疫印跡顯示兩個靶位點的發(fā)夾狀小干涉RNA分被使HIF-1α蛋白表達下降66％和90％。 結

7、論:通過體內(nèi)轉錄生成的發(fā)夾狀小干涉RNA能夠使骨肉瘤細胞缺氧誘導因子HIF-1α基因沉默。 四.靶向HIF-1α的siRNA治療骨肉瘤的體內(nèi)外實驗研究 目的:觀察靶向缺氧誘導因子HIF-1α的短發(fā)夾狀小干擾RNA基因轉染對骨肉瘤生長的影響。 方法:針對HIF-1α構建短發(fā)夾狀小干擾RNA真核表達載體并轉染骨肉瘤細胞系SaOS-2。骨肉瘤細胞置于缺氧誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MTT比色分析檢測細胞體外增殖活力，DNA凝膠電

8、泳、透射電鏡、原位末端標記TUNEL法、AnnexinV/PI雙標記法檢測細胞的凋亡。同時，建立裸鼠移植瘤模型，通過常規(guī)HE染色、HIF-1α、CD34免疫組化觀察HIF-1α基因沉默后對骨肉瘤體內(nèi)治療效果。 結果:靶向缺氧誘導因子HIF-1α的短發(fā)夾狀小干擾RNA能夠顯著降低骨肉瘤細胞的增殖活性和誘導細胞凋亡。裸鼠移植瘤實驗顯示轉染組腫瘤生長減慢，腫瘤組織中可見大量壞死組織。瘤組織HIF-1α蛋白表達降低，微血管密度顯著低于對