骨髓間充質干細胞移植治療帕金森病模型鼠的研究.pdf

1、帕金森病(PD)是一種錐體外系疾病，主要病理改變?yōu)橹心X黑質多巴胺神經元進行性變性和壞死。由于患者的黑質紋狀體通路受損，導致黑質轉運到紋狀體的多巴胺含量減少，從而引起靜止性震顫、肌強直和運動障礙等臨床癥侯群。目前神經干細胞和胎腦組織的移植被認為是可能有潛在應用價值的手段，但由于存在倫理問題和免疫排斥等問題，限制了它們在臨床上的應用。因此，最理想的移植是移植物既能保持一定的數量和長期在體內存活，而且能產生多巴胺和分泌各種營養(yǎng)因子，從而改善移

2、植區(qū)的營養(yǎng)狀況和阻止PD進行性惡化，達到治愈PD的目的。本研究首先從體外探討了骨髓問充質干細胞(Bonemesenchymalstemcell，MSCs)神經分化的可能性，研究了MSCs對MPP+損傷的離體腦片的保護作用及其機理。在此基礎上，將MSCs移植至PD模型鼠腦內，應用MR成像技術在體觀察了移植的MSCs在腦內分布和遷徙情況，探討了MSCs移植治療PD的效果，為MSCs移植治療PD提供了有價值的實驗依據。 第一部分體外不

3、同培養(yǎng)條件對骨髓間充質干細胞神經分化的影響 目的：探討不同條件培養(yǎng)的MSCs能否在體外向神經細胞分化的可能性。 方法：取成年大鼠骨髓，培養(yǎng)、分離和純化骨髓間充質干細胞。將培養(yǎng)的第4代MSCs隨機分為五組，其中三組分別置于DMEM+FBS、干細胞培養(yǎng)基和神經元培養(yǎng)基，另兩組分別與神經元聯合培養(yǎng)和離體紋狀體腦片共培養(yǎng)。相差顯微鏡觀察MSCs的形態(tài)學改變，用免疫熒光組化技術對分化后的細胞進行鑒定，用RT-PCR檢測不同條件培養(yǎng)

4、的MSCs部分標志基因的表達。 結果：MSCs與神經元聯合培養(yǎng)14天，大部分MSCs的細胞形態(tài)并未發(fā)生明顯的改變，細胞呈長扁平狀。少量的MSCs形態(tài)呈強折光的錐形或圓形胞體以及有長的多極突起，免疫熒光顯示它們明顯地表達了MAP-2和GFAP；MSCs與離體腦片共培養(yǎng)14天，部分MSCs細胞核變大并生成突起，有很強的Nestin表達；用不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的其他三組MSCs未發(fā)生明顯的變化。RT-PCR結果表明，不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)的MSC

5、s，其Nestin、GFAP和MAP-2的基因表達亦無明顯變化。 結論：MSCs與神經元聯合培養(yǎng)或MSCs與腦片之間的接觸是MSCs向神經細胞分化的重要條件。 第二部分骨髓間充質干細胞對離體大鼠紋狀體-黑質腦片的作用 目的：探討骨髓間充質干細胞對MPP+損傷的離體黑質-紋狀體腦片多巴胺能神經元的保護作用以及對單胺類神經遞質的影響。 方法：建立MPP+損傷的離體腦片模型。取成年大鼠骨髓，培養(yǎng)、分離和純化骨髓

6、間充質干細胞。將骨髓間充質干細胞與離體腦片聯合培養(yǎng)，通過免疫組化和電鏡等方法觀察骨髓問充質干細胞對聯合培養(yǎng)的MPP+損傷腦片的保護作用。用高效液相色譜分析腦片和培液中多巴胺及其代謝產物3，4-二羥苯乙酸和高香草酸水平的變化。 結果：MPP+可造成離體黑質-紋狀體腦片的細胞大量死亡，但與MSCs聯合培養(yǎng)7天，腦片周圍神經軸突生長增多，腦片中的細胞死亡減少、超微結構損傷減輕、表達TH的陽性細胞數目增多(p＜0.05)。MPP+損傷的

7、腦片組織中的多巴胺含量與正常組和聯合培養(yǎng)組相比明顯減少(p＜0.01)，前者培液中的3，4-二羥苯乙酸和高香草酸水平也顯著減少(p＜0.05)，但聯合培養(yǎng)組與正常組相比上述物質無顯著差異。 結論：MSCs在體外能促進受損的黑質多巴胺能神經元存活，可望用于帕金森病的移植治療。 第三部分超順磁氧化鐵標記骨髓間充質干細胞移植治療 帕金森模型鼠的實驗研究 目的：觀察移植的MSCs在PD模型鼠腦內的遷移及分化，探討

8、MSCs移植治療PD的可能性。研究應用超順磁氧化鐵(SPIO)和BrdU標記骨髓間充質干細胞(MSCs)移植治療帕金森病(PD)大鼠的活體MRI觀察及組織學觀察。 方法：分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，一組MSCs用脂質體轉染法進行SPIO標記，另一組MSCs用BrdU標記；制作PD大鼠模型，將不同標記的MSCs分別移植到PD大鼠右側紋狀體區(qū)，利用阿樸嗎啡觀察PD鼠的行為學變化，采用MRI在體觀察腦內移植的MSCs存活和遷徙情況

9、。應用透射電鏡和免疫熒光雙標法觀察移植后的MSCs增殖和分化。 結果：體外SPIO標記的骨髓間充質干細胞為普魯氏藍染色陽性；對移植了SPIO標記MSCs的PD大鼠行磁共振檢查，T2和T2GRE掃描在移植區(qū)呈低信號改變，隨時問的延長，移植區(qū)信號向周圍擴大，但信號減弱。普魯氏藍染色顯示腦紋狀體區(qū)SPIO標記的MSCs從移植部位向四周遷移。電鏡顯示，SPIO標記的MSCs呈類神經元形態(tài)。免疫熒光組化結果表明，MSCs移植后4周，在移植