抗PRRSV--GP5蛋白豬源抗體基因的克隆、表達.pdf

1、豬繁殖與呼吸障礙綜合征(PRRS)，是世界范圍內(nèi)威脅養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一，主要引起母豬繁殖障礙和仔豬呼吸系統(tǒng)疾病。雖然各國在防控PRRS方面投入了巨大財力，但并未消除PRRSV在全世界范圍內(nèi)的流行與傳播。傳統(tǒng)的快速診斷PRRSV抗原或抗體的方法包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)診斷技術以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。但RT-PCR技術的高靈敏度會導致假陽性結果的出現(xiàn)，而商品化的ELISA診斷試劑盒價格昂貴，因此，尋找特異性

2、高而又價格低廉的診斷PRRS的方法勢在必行。近幾年來，隨著DNA重組技術以及蛋白質(zhì)工程技術日趨成熟，基因工程抗體被大規(guī)模生產(chǎn)以應用于臨床疾病的診斷。重組抗體具有制備時間短，生產(chǎn)成本低，便于改造，而且能特異性識別病原微生物等優(yōu)點，在動物疾?。ㄈ鏟RRS）的鑒別和診斷方面具有廣闊前景。
　　為制備與PRRSV具有反應活性的豬源化重組抗體(PrAb)，在本實驗中，我們以PRRSV疫苗對巴馬豬進行免疫，待在豬體內(nèi)檢測到抗PRRSV-GP5

3、抗體后，對其進行剖殺，采集外周血，分離外周血淋巴細胞。通過流式細胞術，以含保守表位的多肽及抗豬IgG抗體，篩選出能夠與PRRSV抗原表位結合的來自同一克隆的陽性B細胞，利用RT-PCR從B細胞中擴增編碼抗體重鏈可變區(qū)(VH)基因序列和輕鏈可變區(qū)(VL)基因序列，將擴增的可VH和VL分別與實驗室保存的豬源抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)(CH)基因序列連接后，以Linker序列將輕鏈和重鏈全長基因序列相連，構建全長的豬源抗體編碼基因（H

4、-linker-I）。將該連接產(chǎn)物克隆至載體pET-28a中，酶切鑒定及測序鑒定正確后，轉(zhuǎn)化表達菌BL21，利用原核表達系統(tǒng)進行蛋白表達，并對表達的蛋白進行純化。利用蛋白免疫印跡試驗(Western blot)對表達出的目的蛋白種屬進行鑒定，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)鑒定目的蛋白與PRRSV的反應活性。WB結果顯示，表達的重組蛋白與抗豬IgG抗體結合呈陽性反應，而與抗鼠IgG呈陰性反應，表明表達的重組蛋白為PrAb;經(jīng)ELISA

5、鑒定，PrAb與PRRSV弱毒株CH1R和強毒株HuN4呈陽性反應，表明所制備的PrAb為PRRSV特異性抗體。
　　本實驗中，我們建立了利用保守抗原表位及抗B細胞表面抗原抗體篩選來自同一克隆特異性B細胞的方法，成功擴增出豬源抗體的VH和VL編碼序列，并構建了豬源重組抗體原核表達載體，成功表達出了能和PRRSV特異性結合的豬源重組抗體，為利用B細胞法制備抗其他病原微生物抗體提供了借鑒，獲得了能和PRRSV特異性結合的重組抗體，為用