脫細胞材料應用于眼部修復的實驗研究.pdf

1、隨著經濟的進步，我國城鄉(xiāng)工業(yè)不斷發(fā)展，但是對勞動者的有效防護措施并沒有得到順利實施，因此在眼部整形手術中，繼發(fā)于機械性、化學性、熱損傷的眼瞼缺損、眶周組織缺損等情況日益增多。它們不僅會引起眼閉合不全和眼表組織的暴露，還會因持續(xù)而難以矯正的干眼導致角膜上皮壞死、基質融解，進而引發(fā)角膜潰瘍穿孔，甚至失明，使得大量勞動者因此而喪失勞動能力。同時，上述情況還嚴重影響了患者的外觀，這在生活質量日益重要的今天，對于患者的心理乃至社會交往都形成了明顯

2、的阻礙。 少于三分之一長度的眼瞼全層缺損可以通過直接縫合來修補，較大的缺損直接縫合相對困難，傳統(tǒng)的手術方式多是利用正常眼瞼組織或鄰近組織進行修補，但是這些方法對組織損傷大，手術過程復雜。因此近年來采用眼瞼缺損原位重建術(Eyelidreconstructioninprimaryposition)，用皮膚、瞼板替代物和結膜替代物對眼瞼的不同層次分別修復，既不破壞周圍健康組織，又可以恢復較為滿意的解剖結構和外觀。在眼瞼原位重建術中，

3、瞼板的重建是手術的關鍵，因為眼瞼的外形和功能的完整性依賴于瞼板的支撐，如果沒有合適的瞼板，眼瞼修復后會因缺少具有一定硬度的支撐物而出現(xiàn)瞼內翻、瞼退縮，從而導致手術失敗。理想的瞼板替代物一方面應該與瞼板有相似的厚度、硬度、彈性及光滑的基底面，另一方面應該具備易獲取，術中操作簡單，術后炎癥反應輕等特性。 脫細胞組織基質(AcellularTissueMatrix，ACTM)是近年來生物衍生材料方面的研究熱點。自從Meezan于197

4、5年用化學除垢劑制作了一些組織的無細胞基底膜以來，現(xiàn)在脫細胞組織基質的制備多是以此基礎發(fā)展而來：即用化學除垢劑聯(lián)合其他輔助試劑脫去組織中的所有細胞、抗原、脂質、可溶性蛋白質等物質，保留具有完整外觀形態(tài)和組織學及超微結構的不溶性基質成分，主要包括膠原、彈性蛋白、蛋白多糖、糖胺多糖和非膠原糖蛋白。因此，脫細胞組織基質不僅可以維持組織的正常構型，還可以為細胞再生提供支架，同時因為除去了引起免疫反應的細胞成分，因而避免了排斥反應的發(fā)生。目前，以

5、脫細胞真皮為主的脫細胞組織基質已在眼科領域內得到廣泛應用并收到良好效果。 硬腦膜和鞏膜同真皮的構成類似，主要成分均是交織排列的膠原纖維，其中夾雜少量成纖維細胞、血管、內皮細胞等，是眼部整形常用的異體修復材料，國外的一些廠商曾將異體組織進行商品化生產，價格昂貴。但由于異體組織的抗原性強、容易傳播疾病，故其應用受到限制。因此，本研究探索將硬腦膜和鞏膜制備成脫細胞組織基質的方法，從形態(tài)學上觀察其對瞼板組織的重塑效果，從免疫學改變方面分

6、析植入兔上瞼后硬腦膜和鞏膜抗原性的變化，為眼部修復手術尋找新的組織工程學材料。目前國內外尚未見使用脫細胞處理的硬腦膜、鞏膜進行眼部修復的相關報道。 第一部分脫細胞組織的制備與鑒定 目的:以不同方法制備脫細胞硬腦膜和鞏膜，比較不同方法、濃度、作用時間對硬腦膜和鞏膜脫細胞效果的差異，找到適合硬腦膜和鞏膜的脫細胞方法。 方法:將取自8只新西蘭大白兔的硬腦膜和鞏膜組織剪成小塊，每種組織塊均分為8組，每組含有硬腦膜和鞏膜兩

7、種組織，4組用以0.5％、1％、2％、5％的TritonX-100為主，輔以DNase、RNase的方法處理，另外4組用0.25％胰蛋白酶和0.1％SDS分別處理12h+12h，12h+24h，24h+12h，24h+24h。完成后分別從大體觀察8組的外觀，HE染色比較脫細胞后的細胞殘留數(shù)，透射電鏡觀察膠原纖維的超微結構。 結果:以TritonX-100處理后的組織外觀與處理前相似，0.25％胰蛋白酶處理后的組織腫脹增厚。2％、

8、5％TritonX-100兩組和0.25％胰蛋白酶+0.1％SDS處理時間≥36h的三組組織內的細胞殘留平均數(shù)都小于2個/高倍鏡視野。電鏡結果證實，硬腦膜和鞏膜經過脫細胞處理后，膠原纖維結構同處理前相同，未受到破壞。 結論:以TritonX-100處理的硬腦膜和鞏膜結構緊湊，膠原纖維保存完好，其中，2％TritonX-100濃度處理過的組織殘留細胞少，處理前后外觀改變少，是適合硬腦膜和鞏膜進行脫細胞處理的方法。 第二部分

9、脫細胞硬腦膜行眼瞼修復的形態(tài)學及抗原性研究 目的:研究脫細胞硬腦膜植入新西蘭大白兔上瞼后的組織相容性，比較硬腦膜經脫細胞處理前后抗原性的變化。 方法:用2％TritonX-100輔以DNase、RNase制備兔脫細胞硬腦膜。將20只新西蘭大白兔隨機平均分為兩組，每組10只，去除右上瞼10mm×3mm的瞼板后，分別植入兔交聯(lián)型異體脫細胞硬腦膜和異體硬腦膜。于植入后1周、4周、8周取兔外周血，行IgG、IgA、IgM、C3、

10、C4的定量測定；并用流式細胞儀檢測CD4+T細胞、CD8+T細胞。于術后1周、4周、8周、12周取出植片，行免疫組織化學和HE染色檢查。 結果:脫細胞硬腦膜植入上瞼第1周，兩組動物外周血中IgG分別是異體硬腦膜：0.095g/l，脫細胞硬腦膜：0.07g/l，p＜0.05，兩組間有顯著性差異；IgA、IgM、C3和C4的改變無明顯差異。術后4周、8周，兩組間IgG、IgA、IgM、C3、C4和CD4+T細胞、CD8+T細胞定量均

11、無明顯差異，p＞0.05。術后1周、4周、8周、12周，植入局部的光鏡顯示：脫細胞硬腦膜組的炎癥反應和淋巴細胞浸潤要小于異體硬腦膜組，成纖維細胞和新生血管長入情況相似，宿主成纖維細胞于術后8周基本完全長入植片。術后1、4、8周，CD4+T細胞計數(shù)顯示：脫細胞硬腦膜組明顯少于異體硬腦膜組，分別為5±2個、9±4個、11±3個；異體硬腦膜組分別為10±3個、31±4個、24±4個。CD8+T細胞計數(shù)：脫細胞組分別為：4±2個、8±2個、10

12、±3個；異體硬腦膜組分別為10±3個、23±5個、22±5個。 結論:脫細胞硬腦膜植入眼部后顯示出良好的組織相容性，可以有效地引導受體成纖維細胞和血管的長入，引起的炎癥反應及淋巴細胞浸潤較異體硬腦膜小，可以成為外眼組織修復手術中有應用價值的新型生物材料。 第三部分脫細胞鞏膜行眼瞼修復的形態(tài)學及抗原性研究 目的:研究脫細胞鞏膜植入新西蘭大白兔上瞼后的組織相容性，比較鞏膜經脫細胞處理前后抗原性的變化。 方法:

13、用2％TritonX-100輔以DNase、RNase制備兔脫細胞鞏膜。將20只新西蘭大白兔隨機平均分為兩組，每組10只，去除右上瞼10mm×3mm的瞼板后，分別植入兔交聯(lián)型異體脫細胞鞏膜和異體鞏膜。于植入后1周、4周、8周取兔外周血，行IgG、IgA、IgM、C3、C4的定量測定；并于術后4周、8周用流式細胞儀檢測外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞。于術后1周、4周、8周、12周取出植片，行免疫組織化學和HE染色檢查。 結果

14、:脫細胞鞏膜和異體鞏膜植入上瞼后第1周、4周、8周，兩組間外周血IgG、IgA、IgM、C3、C4和CD4+T細胞、CD8+T細胞定量均無明顯差異，p＞0.05。術后1周、4周、8周，植入局部的光鏡顯示：脫細胞鞏膜組的炎癥反應和淋巴細胞浸潤要小于異體鞏膜組，8周后植入的異體鞏膜組織中央部發(fā)生少量壞死溶解現(xiàn)象，兩組成纖維細胞和新生血管長入情況相似，于術后12周基本完全長入植片。術后1、4、8周，CD4+T細胞計數(shù)顯示：脫細胞鞏膜組明顯少于